Bệnh Alzheimer (AD) thiếu các dấu ấn sinh học protein phản ánh nhiều sinh lý bệnh cơ bản của nó, cản trở tiến trình chẩn đoán và điều trị. Ở đây, chúng tôi sử dụng proteomics toàn diện để xác định các dấu ấn sinh học dịch não tủy (CSF) đại diện cho một loạt sinh lý bệnh AD. Phép đo khối phổ đa kênh đã xác định lần lượt khoảng 3.500 và khoảng 12.000 protein trong AD CSF và não. Phân tích mạng lưới của hệ protein não đã giải quyết được 44 mô-đun đa dạng sinh học, 15 mô-đun trong số đó trùng lặp với hệ protein dịch não tủy. Các điểm đánh dấu CSF AD trong các mô-đun chồng chéo này được xếp thành năm nhóm protein, đại diện cho các quá trình sinh lý bệnh khác nhau. Các khớp thần kinh và chất chuyển hóa trong não AD giảm, nhưng CSF tăng lên, trong khi các nhóm myelin hóa và miễn dịch giàu thần kinh đệm trong não và CSF tăng lên. Tính nhất quán và tính đặc hiệu của bệnh của những thay đổi trong bảng đã được xác nhận trong hơn 500 mẫu CSF bổ sung. Các nhóm này cũng xác định các phân nhóm sinh học trong bệnh AD không có triệu chứng. Nhìn chung, những kết quả này là một bước đi đầy hứa hẹn đối với các công cụ đánh dấu sinh học dựa trên web cho các ứng dụng lâm sàng trong AD.
Bệnh Alzheimer (AD) là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra chứng mất trí nhớ thoái hóa thần kinh trên toàn thế giới và được đặc trưng bởi một loạt các rối loạn chức năng hệ thống sinh học, bao gồm truyền dẫn qua khớp thần kinh, miễn dịch qua trung gian thần kinh đệm và chuyển hóa ty thể (1-3). Tuy nhiên, các dấu ấn sinh học protein đã được thiết lập vẫn tập trung vào việc phát hiện protein amyloid và tau, do đó không thể phản ánh sinh lý bệnh đa dạng này. Các dấu ấn sinh học protein “lõi” này được đo lường một cách đáng tin cậy nhất trong dịch não tủy (CSF) bao gồm (i) amyloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42), phản ánh sự hình thành các mảng amyloid vỏ não; (ii) tau toàn phần, dấu hiệu của sự thoái hóa sợi trục; (iii) phospho-tau (p-tau), một đại diện của quá trình tăng phospho bệnh lý tau (4-7). Mặc dù các dấu ấn sinh học dịch não tủy này đã hỗ trợ rất nhiều cho việc phát hiện các bệnh protein AD “được đánh dấu” (4-7), nhưng chúng chỉ đại diện cho một phần nhỏ của cơ chế sinh học phức tạp đằng sau căn bệnh này.
Việc thiếu tính đa dạng sinh lý bệnh của các dấu ấn sinh học AD đã dẫn đến nhiều thách thức, bao gồm (i) không có khả năng xác định và định lượng tính không đồng nhất sinh học của bệnh nhân AD, (ii) đo lường không đầy đủ mức độ nghiêm trọng và tiến triển của bệnh, đặc biệt là ở giai đoạn tiền lâm sàng, Và ( iii) sự phát triển của các loại thuốc điều trị không giải quyết được hoàn toàn mọi khía cạnh của tình trạng suy thoái thần kinh. Việc chúng tôi dựa vào bệnh lý mang tính bước ngoặt để mô tả AD từ các bệnh liên quan chỉ làm trầm trọng thêm những vấn đề này. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy hầu hết người cao tuổi mắc chứng sa sút trí tuệ đều có nhiều hơn một đặc điểm bệnh lý là suy giảm nhận thức (8). Có tới 90% hoặc nhiều hơn những người mắc bệnh AD cũng mắc bệnh mạch máu, thể vùi TDP-43 hoặc các bệnh thoái hóa khác (9). Tỷ lệ chồng chéo bệnh lý cao này đã phá vỡ khuôn khổ chẩn đoán hiện tại của chúng ta về chứng mất trí nhớ và cần có một định nghĩa sinh lý bệnh toàn diện hơn về căn bệnh này.
Trước nhu cầu cấp thiết về nhiều loại dấu ấn sinh học AD, lĩnh vực này ngày càng áp dụng phương pháp “omics” dựa trên hệ thống tổng thể để khám phá các dấu ấn sinh học. Liên minh Đối tác Dược phẩm Tăng tốc (AMP)-AD được thành lập vào năm 2014 và đi đầu trong chương trình. Nỗ lực đa ngành này của Viện Y tế Quốc gia, học viện và ngành công nghiệp nhằm mục đích sử dụng các chiến lược dựa trên hệ thống để xác định rõ hơn sinh lý bệnh của AD và phát triển các chiến lược điều trị và phân tích chẩn đoán đa dạng sinh học (10). Là một phần của dự án này, hệ thống protein mạng đã trở thành một công cụ đầy hứa hẹn cho sự phát triển của các dấu ấn sinh học dựa trên hệ thống trong AD. Cách tiếp cận dựa trên dữ liệu không thiên vị này tổ chức các bộ dữ liệu protein phức tạp thành các nhóm hoặc “mô-đun” của các protein đồng biểu hiện có liên quan đến các loại tế bào, bào quan và chức năng sinh học cụ thể (11-13). Gần 12 nghiên cứu về protein mạng lưới giàu thông tin đã được tiến hành trên não AD (13-23). Nhìn chung, những phân tích này chỉ ra rằng hệ protein mạng não AD duy trì một tổ chức mô-đun được bảo tồn cao trong các đoàn hệ độc lập và nhiều vùng vỏ não. Ngoài ra, một số mô-đun này cho thấy những thay đổi có thể lặp lại về mức độ phong phú liên quan đến AD trên các bộ dữ liệu, phản ánh sinh lý bệnh của nhiều bệnh. Nói chung, những phát hiện này chứng minh một điểm neo đầy hứa hẹn cho việc phát hiện ra hệ protein mạng não như một dấu ấn sinh học dựa trên hệ thống trong AD.
Để biến hệ protein mạng lưới não AD thành các dấu ấn sinh học dựa trên hệ thống hữu ích về mặt lâm sàng, chúng tôi đã kết hợp mạng lưới có nguồn gốc từ não với phân tích protein của AD CSF. Cách tiếp cận tích hợp này đã dẫn đến việc xác định năm bộ dấu ấn sinh học CSF đầy hứa hẹn có liên quan đến nhiều loại sinh lý bệnh dựa trên não, bao gồm các khớp thần kinh, mạch máu, quá trình myel hóa, viêm và rối loạn chức năng của quá trình trao đổi chất. Chúng tôi đã xác nhận thành công các bảng dấu ấn sinh học này thông qua nhiều phân tích sao chép, bao gồm hơn 500 mẫu CSF từ các bệnh thoái hóa thần kinh khác nhau. Những phân tích xác nhận này bao gồm kiểm tra các mục tiêu nhóm trong CSF của bệnh nhân mắc AD không có triệu chứng (AsymAD) hoặc cho thấy bằng chứng về sự tích tụ amyloid bất thường trong môi trường nhận thức bình thường. Những phân tích này nêu bật tính không đồng nhất sinh học đáng kể trong quần thể AsymAD và xác định các dấu hiệu bảng có thể phân nhóm các cá thể trong giai đoạn sớm nhất của bệnh. Nhìn chung, những kết quả này thể hiện một bước quan trọng trong việc phát triển các công cụ đánh dấu sinh học protein dựa trên nhiều hệ thống có thể giải quyết thành công nhiều thách thức lâm sàng mà AD phải đối mặt.
Mục đích chính của nghiên cứu này là xác định các dấu ấn sinh học dịch não tủy mới phản ánh các sinh lý bệnh khác nhau dựa trên não dẫn đến AD. Hình S1 phác thảo phương pháp nghiên cứu của chúng tôi, bao gồm (i) phân tích toàn diện dựa trên những phát hiện ban đầu về AD CSF và hệ protein não mạng để xác định nhiều dấu ấn sinh học bệnh CSF liên quan đến não và (ii) sao chép tiếp theo. đoàn hệ chất lỏng. Nghiên cứu theo định hướng khám phá bắt đầu bằng việc phân tích biểu hiện khác biệt của CSF ở 20 người bình thường về nhận thức và 20 bệnh nhân AD tại Trung tâm Nghiên cứu Bệnh Alzheimer Emory Goizueta (ADRC). Chẩn đoán AD được xác định là tình trạng suy giảm nhận thức đáng kể khi có Aβ1-42 thấp và nồng độ tổng tau và p-tau trong dịch não tủy tăng cao [Đánh giá nhận thức trung bình Montreal (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Bảng S1A). Đối chứng (MoCA trung bình, 26,7 ± 2,2) có mức dấu ấn sinh học CSF bình thường.
Dịch não tủy ở người được đặc trưng bởi mức độ phong phú protein đa dạng, trong đó albumin và các protein cực kỳ phong phú khác có thể ngăn cản việc phát hiện các protein quan tâm (24). Để tăng chiều sâu khám phá protein, chúng tôi đã loại bỏ 14 protein có hàm lượng cao đầu tiên khỏi mỗi mẫu CSF trước khi phân tích khối phổ (MS) (24). Tổng cộng có 39.805 peptide đã được MS xác định, được ánh xạ tới 3691 protein trong 40 mẫu. Việc định lượng protein được thực hiện bằng cách ghi nhãn nhiều thẻ khối lượng song song (TMT) (18, 25). Để giải quyết dữ liệu còn thiếu, chúng tôi chỉ đưa vào những protein đã được định lượng trong ít nhất 50% số mẫu trong phân tích tiếp theo, do đó cuối cùng đã định lượng được 2875 protein. Do sự khác biệt đáng kể về tổng mức độ phong phú protein, mẫu đối chứng được thống kê coi là ngoại lệ (13) và không được đưa vào phân tích tiếp theo. Giá trị độ phong phú của 39 mẫu còn lại được điều chỉnh theo độ tuổi, giới tính và hiệp phương sai lô (13-15, 17, 18, 20, 26).
Sử dụng phân tích kiểm tra t thống kê để đánh giá biểu thức khác biệt trên tập dữ liệu hồi quy, phân tích này đã xác định các protein có mức độ phong phú thay đổi đáng kể (P <0,05) giữa trường hợp đối chứng và trường hợp AD (Bảng S2A). Như được hiển thị trong Hình 1A, mức độ phong phú của tổng số 225 protein trong AD đã giảm đáng kể và mức độ phong phú của 303 protein đã tăng lên đáng kể. Những protein được biểu hiện khác biệt này bao gồm một số dấu hiệu AD của dịch não tủy đã được xác định trước đó, chẳng hạn như protein tau liên quan đến vi ống (MAPT; P = 3,52 × 10−8), sợi thần kinh (NEFL; P = 6,56 × 10−3), Protein liên quan đến tăng trưởng 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Protein liên kết axit béo 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Chitinase 3 like 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Granulin thần kinh (NRGN; P = 3,43 × 10−4) và yếu tố tăng trưởng thần kinh VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Tuy nhiên, chúng tôi cũng xác định các mục tiêu rất quan trọng khác, chẳng hạn như chất ức chế phân ly GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) và liên kết canxi mô-đun liên quan đến SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9) . Phân tích Gene Onology (GO) của 225 protein bị giảm đáng kể cho thấy mối liên hệ chặt chẽ với các quá trình dịch cơ thể như chuyển hóa steroid, đông máu và hoạt động của hormone (Hình 1B và Bảng S2B). Ngược lại, lượng protein 303 tăng lên đáng kể có liên quan chặt chẽ đến cấu trúc tế bào và chuyển hóa năng lượng.
(A) Biểu đồ núi lửa hiển thị sự thay đổi lần log2 (trục x) so với giá trị P thống kê -log10 (trục y) thu được bằng thử nghiệm t, được sử dụng để phát hiện biểu thức khác biệt giữa điều khiển (CT) và Các trường hợp AD của hệ protein CSF của tất cả các protein. Các protein có mức giảm đáng kể (P <0,05) trong AD được hiển thị bằng màu xanh lam, trong khi các protein có mức độ bệnh tăng đáng kể được hiển thị bằng màu đỏ. Protein được chọn sẽ được dán nhãn. (B) Các thuật ngữ GO hàng đầu liên quan đến protein giảm đáng kể (màu xanh) và tăng (màu đỏ) trong AD. Hiển thị ba thuật ngữ GO có điểm z cao nhất trong các lĩnh vực quá trình sinh học, chức năng phân tử và thành phần tế bào. (C) MS đo mức MAPT trong mẫu CSF (trái) và mối tương quan của nó với mức tau ELISA mẫu (phải). Hệ số tương quan Pearson với giá trị P liên quan được hiển thị. Do thiếu dữ liệu ELISA cho một trường hợp AD, những số liệu này bao gồm giá trị của 38 trong số 39 trường hợp được phân tích. (D) Phân tích cụm được giám sát (P <0,0001, Stewamini-Hochberg (BH) đã điều chỉnh P <0,01) trên mẫu đối chứng và AD CSF đã tìm thấy các mẫu sử dụng 65 protein được thay đổi đáng kể nhất trong tập dữ liệu. Chuẩn hóa, bình thường hóa.
Mức độ proteomic của MAPT có liên quan chặt chẽ với mức tau ELISA được đo độc lập (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Hình 1C), hỗ trợ tính hợp lệ của phép đo MS của chúng tôi. Sau khi tiêu hóa trypsin ở mức protein tiền chất amyloid (APP), các peptide đặc hiệu isoform được ánh xạ tới đầu C của Aβ1-40 và Aβ1-42 không thể bị ion hóa một cách hiệu quả (27, 28). Do đó, các peptide APP mà chúng tôi đã xác định không liên quan gì đến mức ELISA Aβ1-42. Để đánh giá biểu hiện khác biệt của từng trường hợp, chúng tôi đã sử dụng các protein được biểu thị khác nhau với P <0, 0001 [tỷ lệ phát hiện sai (FDR) đã sửa P <0, 01] để thực hiện phân tích cụm mẫu có giám sát (Bảng S2A). Như được hiển thị trong Hình 1D, 65 protein có ý nghĩa cao này có thể phân cụm mẫu một cách chính xác tùy theo trạng thái bệnh, ngoại trừ một trường hợp AD có đặc điểm giống đối chứng. Trong số 65 protein này, 63 protein tăng AD, trong khi chỉ có 2 protein (CD74 và ISLR) giảm. Tổng cộng, các phân tích dịch não tủy này đã xác định được hàng trăm protein trong AD có thể đóng vai trò là dấu ấn sinh học của bệnh.
Sau đó, chúng tôi thực hiện phân tích mạng lưới độc lập về hệ protein não AD. Nhóm não của khám phá này bao gồm vỏ não trước trán hai bên (DLPFC) từ nhóm đối chứng (n = 10), bệnh Parkinson (PD; n = 10), các trường hợp AD/PD hỗn hợp (n = 10) và AD (n = 10). ) Vật mẫu. Emery Goizueta ADRC. Nhân khẩu học của 40 trường hợp này đã được mô tả trước đây (25) và được tóm tắt trong Bảng S1B. Chúng tôi đã sử dụng TMT-MS để phân tích 40 mô não này và đoàn hệ sao chép của 27 trường hợp. Tổng cộng, hai bộ dữ liệu não này đã tạo ra 227.121 peptide duy nhất, được ánh xạ tới 12.943 protein (25). Chỉ những protein đã được định lượng trong ít nhất 50% trường hợp mới được đưa vào các nghiên cứu tiếp theo. Bộ dữ liệu khám phá cuối cùng chứa 8817 protein đã được định lượng. Điều chỉnh mức độ dồi dào protein dựa trên độ tuổi, giới tính và khoảng thời gian sau khi chết (PMI). Phân tích biểu hiện khác biệt của tập dữ liệu sau khi hồi quy cho thấy >2000 mức protein đã thay đổi đáng kể [P <0,05, phân tích phương sai (ANOVA)] trong hai hoặc nhiều nhóm bệnh. Sau đó, chúng tôi thực hiện phân tích cụm có giám sát dựa trên các protein được biểu thị khác nhau và P <0,0001 trong so sánh AD/kiểm soát và/hoặc AD/PD (Hình S2, A và B, Bảng S2C). 165 protein bị thay đổi nhiều này mô tả rõ ràng các trường hợp mắc bệnh lý AD từ mẫu đối chứng và mẫu PD, xác nhận những thay đổi mạnh mẽ về AD cụ thể trong toàn bộ hệ protein.
Sau đó, chúng tôi sử dụng một thuật toán có tên là Phân tích mạng đồng biểu hiện gen có trọng số (WGCNA) để thực hiện phân tích mạng trên hệ protein não được phát hiện, thuật toán này sắp xếp tập dữ liệu thành các mô-đun protein với các mẫu biểu hiện tương tự (11-13). Phân tích đã xác định 44 protein đồng biểu hiện mô-đun (M), được sắp xếp và đánh số từ lớn nhất (M1, n = 1821 protein) đến nhỏ nhất (M44, n = 34 protein) (Hình 2A và Bảng S2D)). Như đã đề cập ở trên (13) Tính toán cấu hình biểu hiện đại diện hoặc protein đặc trưng của từng mô-đun và tương quan nó với trạng thái bệnh và bệnh lý AD, nghĩa là thiết lập liên minh giữa Cơ quan đăng ký bệnh Alzheimer (CERAD) và Điểm Braak (Hình 2B). Nhìn chung, 17 mô-đun có liên quan đáng kể đến bệnh lý thần kinh AD (P <0,05). Nhiều mô-đun liên quan đến bệnh tật này cũng rất giàu các dấu hiệu đặc trưng cho loại tế bào (Hình 2B). Như đã đề cập ở trên (13), việc làm giàu loại tế bào được xác định bằng cách phân tích sự chồng chéo mô-đun và danh sách tham chiếu của các gen đặc trưng cho loại tế bào. Những gen này có nguồn gốc từ dữ liệu được công bố về các tế bào thần kinh, tế bào nội mô và tế bào thần kinh đệm của chuột bị cô lập. Thí nghiệm giải trình tự RNA (RNA-seq) (29).
(A) Khám phá WGCNA của hệ protein não. (B) Phân tích mối tương quan giữa trọng lượng (BiCor) của protein đặc trưng mô-đun (thành phần chính đầu tiên của biểu hiện protein mô-đun) với các đặc điểm bệnh lý thần kinh AD (trên cùng), bao gồm điểm CERAD (mảng bám Aβ) và điểm Braak (tau tangles). Cường độ tương quan dương (đỏ) và âm (xanh lam) được thể hiện bằng bản đồ nhiệt hai màu và dấu hoa thị biểu thị ý nghĩa thống kê (P <0,05). Sử dụng Thử nghiệm chính xác siêu hình học của Fisher (FET) (phía dưới) để đánh giá mối liên hệ loại tế bào của từng mô-đun protein. Cường độ của màu đỏ biểu thị mức độ làm giàu của loại tế bào và dấu hoa thị biểu thị ý nghĩa thống kê (P <0,05). Sử dụng phương pháp BH để sửa giá trị P thu được từ FET. (C) Phân tích GO của protein mô-đun. Các quy trình sinh học có liên quan chặt chẽ nhất được hiển thị cho từng mô-đun hoặc nhóm mô-đun liên quan. oligo, tế bào ít nhánh.
Một bộ năm mô-đun giàu tế bào hình sao và microglia có liên quan chặt chẽ (M30, M29, M18, M24 và M5) cho thấy mối tương quan tích cực mạnh mẽ với bệnh lý thần kinh AD (Hình 2B). Phân tích bản thể học liên kết các mô-đun thần kinh đệm này với sự phát triển, tăng sinh và miễn dịch của tế bào (Hình 2C và Bảng S2E). Hai mô-đun thần kinh đệm bổ sung, M8 và M22, cũng được điều chỉnh mạnh mẽ trong bệnh tật. M8 có liên quan nhiều đến con đường thụ thể giống Toll, một tầng tín hiệu đóng vai trò chính trong phản ứng miễn dịch bẩm sinh (30). Đồng thời, M22 có liên quan chặt chẽ đến sửa đổi hậu dịch mã. M2, rất giàu oligodendrocytes, cho thấy mối tương quan tích cực mạnh mẽ với bệnh lý AD và mối liên hệ bản thể với sự tổng hợp nucleoside và sao chép DNA, cho thấy sự tăng sinh tế bào được tăng cường trong các bệnh. Nhìn chung, những phát hiện này hỗ trợ cho việc nâng cao các mô-đun thần kinh đệm mà trước đây chúng tôi đã quan sát thấy trong hệ protein mạng AD (13, 17). Hiện tại, người ta nhận thấy rằng nhiều mô-đun thần kinh đệm liên quan đến AD trong mạng hiển thị mức biểu hiện thấp hơn trong các trường hợp kiểm soát và PD, làm nổi bật tính đặc hiệu bệnh của chúng được nâng lên trong AD (Hình S2C).
Chỉ có bốn mô-đun trong hệ protein mạng của chúng tôi (M1, M3, M10 và M32) có mối tương quan nghịch mạnh với bệnh lý AD (P <0,05) (Hình 2, B và C). Cả M1 và M3 đều giàu chất đánh dấu tế bào thần kinh. M1 liên quan nhiều đến tín hiệu khớp thần kinh, trong khi M3 liên quan chặt chẽ đến chức năng của ty thể. Không có bằng chứng về việc làm giàu loại tế bào đối với M10 và M32. M32 phản ánh mối liên hệ giữa M3 và chuyển hóa tế bào, trong khi M10 liên quan nhiều đến sự phát triển của tế bào và chức năng vi ống. So với AD, cả bốn mô-đun đều được tăng cường khả năng kiểm soát và PD, mang lại cho chúng những thay đổi AD cụ thể theo từng bệnh (Hình S2C). Nhìn chung, những kết quả này hỗ trợ cho việc giảm lượng mô-đun giàu nơ-ron mà chúng tôi đã quan sát thấy trước đây trong AD (13, 17). Tóm lại, phân tích mạng lưới hệ protein não mà chúng tôi phát hiện đã tạo ra các mô-đun được thay đổi dành riêng cho AD phù hợp với những phát hiện trước đây của chúng tôi.
AD được đặc trưng bởi giai đoạn không có triệu chứng sớm (AsymAD), trong đó các cá nhân biểu hiện sự tích tụ amyloid mà không bị suy giảm nhận thức lâm sàng (5, 31). Giai đoạn không có triệu chứng này là thời điểm quan trọng để phát hiện và can thiệp sớm. Trước đây chúng tôi đã chứng minh khả năng bảo tồn mô-đun mạnh mẽ của hệ protein mạng não AsymAD và AD trên các tập dữ liệu độc lập (13, 17). Để đảm bảo rằng mạng não mà chúng tôi hiện đang phát hiện phù hợp với những phát hiện trước đó, chúng tôi đã phân tích việc bảo toàn 44 mô-đun trong bộ dữ liệu được sao chép từ 27 tổ chức DLPFC. Các tổ chức này bao gồm các trường hợp kiểm soát (n = 10), AsymAD (n = 8) và AD (n = 9). Các mẫu đối chứng và AD đã được đưa vào phân tích đoàn hệ não khám phá của chúng tôi (Bảng S1B), trong khi các trường hợp AsymAD chỉ là duy nhất trong đoàn hệ sao chép. Những trường hợp AsymAD này cũng đến từ ngân hàng não Emory Goizueta ADRC. Mặc dù nhận thức vẫn bình thường vào thời điểm chết, nhưng mức độ amyloid cao bất thường (CERAD trung bình, 2,8 ± 0,5) (Bảng S1B).
Phân tích TMT-MS của 27 mô não này đã định lượng được 11.244 protein. Số lượng cuối cùng này chỉ bao gồm những protein được định lượng trong ít nhất 50% số mẫu. Tập dữ liệu được sao chép này chứa 8638 (98,0%) trong số 8817 protein được phát hiện trong phân tích não khám phá của chúng tôi và có gần 3000 protein được thay đổi đáng kể giữa nhóm đối chứng và nhóm AD (P <0,05, sau thử nghiệm t ghép đôi của Tukey để phân tích phương sai) ( Bảng S2F). Trong số các protein được biểu hiện khác nhau này, 910 cũng cho thấy sự thay đổi mức độ đáng kể giữa các trường hợp kiểm soát AD và protein não (P <0,05, sau khi thử nghiệm t ghép đôi ANOVA Tukey). Điều đáng chú ý là các dấu hiệu 910 này có tính nhất quán cao về hướng thay đổi giữa các protein (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Hình S3A). Trong số các protein tăng lên, các protein có sự thay đổi nhất quán nhất giữa các bộ dữ liệu chủ yếu là thành viên của mô-đun M5 và M18 giàu thần kinh đệm (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 và GFAP). Trong số các protein bị giảm, những protein có những thay đổi nhất quán nhất hầu như chỉ là thành viên của mô-đun M1 (NPTX2, VGF và RPH3A) được liên kết với khớp thần kinh. Chúng tôi đã xác minh thêm những thay đổi liên quan đến AD của midkine (MDK), CD44, tiết ra protein 1 liên quan đến rối loạn (SFRP1) và VGF bằng phương pháp làm mờ phương Tây (Hình S3B). Phân tích bảo quản mô-đun cho thấy khoảng 80% mô-đun protein (34/44) trong hệ protein não được bảo tồn đáng kể trong bộ dữ liệu sao chép (z-score > 1,96, FDR đã sửa P <0,05) (Hình S3C). Mười bốn mô-đun này được dành riêng đặc biệt giữa hai protein (z-score> 10, FDR đã sửa P <1.0 × 10−23). Nhìn chung, việc phát hiện và tái tạo mức độ nhất quán cao trong biểu hiện khác biệt và thành phần mô đun giữa hệ protein não làm nổi bật khả năng tái tạo những thay đổi trong protein vỏ não trước AD. Ngoài ra, người ta cũng xác nhận rằng AsymAD và các bệnh tiến triển hơn có cấu trúc mạng lưới não rất giống nhau.
Một phân tích chi tiết hơn về biểu hiện khác biệt trong bộ dữ liệu sao chép não nêu bật mức độ thay đổi đáng kể của protein AsymAD, bao gồm tổng số 151 protein thay đổi đáng kể giữa AsymAD và đối chứng (P <0,05) (Hình S3D). Phù hợp với lượng amyloid, APP trong não của AsymAD và AD tăng lên đáng kể. MAPT chỉ thay đổi đáng kể trong AD, điều này phù hợp với mức độ rối rắm ngày càng tăng và mối tương quan đã biết của nó với sự suy giảm nhận thức (5, 7). Các mô-đun giàu thần kinh đệm (M5 và M18) được phản ánh nhiều qua các protein tăng lên trong AsymAD, trong khi mô-đun M1 liên quan đến tế bào thần kinh là đại diện tiêu biểu nhất cho các protein bị giảm trong AsymAD. Nhiều dấu hiệu AsymAD này cho thấy những thay đổi lớn hơn ở các bệnh có triệu chứng. Trong số các dấu hiệu này có SMOC1, một loại protein thần kinh đệm thuộc M18, có liên quan đến các khối u não và sự phát triển của mắt và tay chân (32). MDK là yếu tố tăng trưởng gắn với heparin liên quan đến sự phát triển của tế bào và sự hình thành mạch (33), một thành viên khác của M18. So với nhóm đối chứng, AsymAD tăng đáng kể, theo sau là AD tăng nhiều hơn. Ngược lại, protein synap thần kinh 2 (NPTX2) đã giảm đáng kể trong não AsymAD. NPTX2 trước đây có liên quan đến thoái hóa thần kinh và có vai trò được công nhận trong việc điều hòa các khớp thần kinh bị kích thích (34). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy nhiều thay đổi protein tiền lâm sàng khác nhau ở AD dường như tiến triển theo mức độ nghiêm trọng của bệnh.
Cho rằng chúng tôi đã đạt được mức độ bao phủ protein đáng kể khi phát hiện ra hệ protein não, chúng tôi đang cố gắng hiểu đầy đủ hơn về sự chồng chéo của nó với hệ thống phiên mã AD ở cấp độ mạng. Do đó, chúng tôi đã so sánh hệ protein não mà chúng tôi đã phát hiện với mô-đun mà chúng tôi đã tạo trước đó từ phép đo microarray của 18.204 gen trong AD (n = 308) và kiểm soát (n = 157) các mô DLPFC (13). chồng chéo. Tổng cộng, chúng tôi đã xác định được 20 mô-đun RNA khác nhau, nhiều mô-đun trong số đó thể hiện sự phong phú của các loại tế bào cụ thể, bao gồm tế bào thần kinh, tế bào ít nhánh, tế bào hình sao và tế bào vi mô (Hình 3A). Nhiều thay đổi của các mô-đun này trong AD được hiển thị trong Hình 3B. Phù hợp với phân tích chồng chéo protein-RNA trước đây của chúng tôi bằng cách sử dụng hệ protein MS không được gắn nhãn sâu hơn (khoảng 3000 protein) (13), hầu hết trong số 44 mô-đun trong mạng lưới hệ protein não mà chúng tôi tìm thấy đều nằm trong mạng lưới phiên mã. Không có sự trùng lặp đáng kể trong đó. Ngay cả trong việc chúng tôi phát hiện và sao chép 34 mô-đun protein được giữ lại cao trong hệ protein não, chỉ 14 (~ 40%) vượt qua bài kiểm tra chính xác của Fisher (FET) được chứng minh là có sự trùng lặp có ý nghĩa thống kê với bản phiên mã (Hình 3A). Tương thích với sửa chữa tổn thương DNA (P-M25 và P-M19), dịch mã protein (P-M7 và P-M20), liên kết/nối RNA (P-M16 và P-M21) và nhắm mục tiêu protein (P-M13 và P- M23) không trùng lặp với các mô-đun trong bảng điểm. Do đó, mặc dù bộ dữ liệu proteome sâu hơn được sử dụng trong phân tích chồng chéo hiện tại (13), hầu hết proteome của mạng AD không được ánh xạ tới mạng phiên mã.
(A) FET siêu hình học thể hiện sự phong phú của các dấu hiệu đặc trưng cho loại tế bào trong mô-đun RNA của bản phiên mã AD (trên cùng) và mức độ chồng chéo giữa các mô-đun RNA (trục x) và protein (trục y) của não AD (đáy) . Cường độ của bóng màu đỏ biểu thị mức độ phong phú của các loại ô ở bảng trên cùng và cường độ chồng chéo của các mô-đun ở bảng dưới cùng. Dấu hoa thị biểu thị ý nghĩa thống kê (P <0, 05). (B) Mức độ tương quan giữa các gen đặc trưng của từng mô-đun phiên mã và trạng thái AD. Các mô-đun bên trái có mối tương quan nghịch nhất với AD (màu xanh) và các mô-đun bên phải có mối tương quan tích cực nhất với AD (màu đỏ). Giá trị P được điều chỉnh BH được chuyển đổi log cho biết mức độ có ý nghĩa thống kê của từng mối tương quan. (C) Các mô-đun chồng chéo đáng kể với việc làm giàu loại ô được chia sẻ. (D) Phân tích tương quan về sự thay đổi lần log2 của protein được dán nhãn (trục x) và RNA (trục y) trong mô-đun chồng chéo. Hệ số tương quan Pearson với giá trị P liên quan được hiển thị. Vi mô, vi thần kinh đệm; các thiên thể, tế bào hình sao. CT, kiểm soát.
Hầu hết các mô-đun protein và RNA chồng chéo đều có chung cấu hình làm giàu loại tế bào và hướng thay đổi AD nhất quán (Hình 3, B và C). Nói cách khác, mô-đun M1 liên quan đến khớp thần kinh của hệ protein não (PM1) được ánh xạ tới ba mô-đun RNA tương đồng giàu tế bào thần kinh (R-M1, R-M9 và R-M16), đều nằm trong AD Cả hai đều cho thấy một mức độ giảm đi. Tương tự, các mô-đun protein M5 và M18 giàu thần kinh đệm trùng lặp với các mô-đun RNA giàu tế bào hình sao và các dấu hiệu vi mô (R-M3, R-M7 và R-M10) và có liên quan nhiều đến các bệnh Gia tăng. Các tính năng mô-đun được chia sẻ này giữa hai bộ dữ liệu hỗ trợ thêm cho việc làm phong phú loại tế bào và những thay đổi liên quan đến bệnh tật mà chúng tôi đã quan sát thấy trong hệ protein não. Tuy nhiên, chúng tôi đã quan sát thấy nhiều sự khác biệt đáng kể giữa mức độ RNA và protein của các dấu hiệu riêng lẻ trong các mô-đun được chia sẻ này. Phân tích tương quan về biểu hiện khác biệt của protein và phiên mã của các phân tử trong các mô-đun chồng chéo này (Hình 3D) làm nổi bật sự không nhất quán này. Ví dụ, APP và một số protein mô-đun thần kinh đệm khác (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 và SFRP1) cho thấy sự gia tăng đáng kể về hệ protein AD, nhưng hầu như không có thay đổi nào trong hệ phiên mã AD. Những thay đổi đặc hiệu về protein này có thể liên quan chặt chẽ với các mảng amyloid (23, 35), làm nổi bật hệ protein là nguồn gốc của những thay đổi bệnh lý và những thay đổi này có thể không được phản ánh trong bản phiên mã.
Sau khi phân tích độc lập não và các protein CSF mà chúng tôi đã phát hiện, chúng tôi đã tiến hành phân tích toàn diện hai bộ dữ liệu để xác định các dấu ấn sinh học AD CSF liên quan đến sinh lý bệnh của mạng lưới não. Trước tiên chúng ta phải xác định sự chồng chéo của hai loại protein. Mặc dù người ta chấp nhận rộng rãi rằng CSF phản ánh những thay đổi hóa học thần kinh trong não AD (4), mức độ trùng lặp chính xác giữa não AD và hệ protein CSF vẫn chưa rõ ràng. Bằng cách so sánh số lượng sản phẩm gen chung được phát hiện trong hai hệ protein của chúng tôi, chúng tôi thấy rằng gần 70% (n = 1936) protein được xác định trong dịch não tủy cũng được định lượng trong não (Hình 4A). Hầu hết các protein chồng chéo này (n = 1721) được ánh xạ tới một trong 44 mô-đun đồng biểu hiện từ bộ dữ liệu não khám phá (Hình 4B). Đúng như dự đoán, sáu mô-đun não lớn nhất (M1 đến M6) thể hiện mức độ chồng chéo CSF lớn nhất. Tuy nhiên, có những mô-đun não nhỏ hơn (ví dụ: M15 và M29) đạt được mức độ chồng chéo cao bất ngờ, lớn hơn mô-đun não có kích thước gấp đôi kích thước của nó. Điều này thúc đẩy chúng tôi áp dụng một phương pháp chi tiết hơn, được thống kê hơn để tính toán sự chồng chéo giữa não và dịch não tủy.
(A và B) Các protein được phát hiện trong bộ não khám phá và bộ dữ liệu CSF chồng lên nhau. Hầu hết các protein chồng chéo này được liên kết với một trong 44 mô-đun đồng biểu hiện của mạng lưới đồng biểu hiện não. (C) Khám phá sự chồng chéo giữa hệ protein dịch não tủy và hệ protein mạng não. Mỗi hàng của bản đồ nhiệt thể hiện một phân tích chồng chéo riêng biệt của FET siêu hình học. Hàng trên cùng mô tả sự chồng chéo (màu xám/đen) giữa mô-đun não và toàn bộ hệ protein CSF. Dòng thứ hai mô tả rằng sự chồng chéo giữa các mô-đun não và protein CSF (được tô màu đỏ) được điều chỉnh tăng đáng kể trong AD (P <0,05). Hàng thứ ba cho thấy sự chồng chéo giữa các mô-đun não và protein CSF (màu xanh lam) được điều chỉnh giảm đáng kể trong AD (P <0,05). Sử dụng phương pháp BH để sửa giá trị P thu được từ FET. (D) Bảng mô-đun gấp dựa trên liên kết loại ô và các thuật ngữ GO liên quan. Những bảng này chứa tổng cộng 271 protein liên quan đến não, có biểu hiện khác biệt có ý nghĩa trong hệ protein CSF.
Bằng cách sử dụng FET một đuôi, chúng tôi đã đánh giá tầm quan trọng của sự chồng chéo protein giữa hệ protein CSF và các mô-đun não riêng lẻ. Phân tích cho thấy tổng cộng 14 mô-đun não trong bộ dữ liệu CSF có sự trùng lặp có ý nghĩa thống kê (P <0,05 được điều chỉnh FDR) và một mô-đun bổ sung (M18) có sự trùng lặp gần với mức có ý nghĩa (P = 0,06 được điều chỉnh FDR) (Hình 4C) , hàng trên cùng). Chúng tôi cũng quan tâm đến các mô-đun có sự trùng lặp mạnh mẽ với các protein CSF được biểu hiện khác nhau. Do đó, chúng tôi đã áp dụng hai phân tích FET bổ sung để xác định (i) protein CSF nào đã tăng đáng kể trong AD và (ii) protein CSF đã giảm đáng kể trong các mô-đun não AD (P <0,05, thử nghiệm t cặp đôi AD/kiểm soát) với sự chồng chéo có ý nghĩa giữa họ. Như được hiển thị ở hàng giữa và dưới cùng của Hình 4C, những phân tích bổ sung này cho thấy 8 trong số 44 mô-đun não trùng lặp đáng kể với protein được thêm vào trong AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 và M38) . ), trong khi chỉ có hai mô-đun (M6 và M15) cho thấy sự trùng lặp có ý nghĩa với protein bị khử trong AD CSF. Đúng như dự đoán, tất cả 10 mô-đun đều nằm trong 15 mô-đun có mức độ trùng lặp cao nhất với hệ protein CSF. Do đó, chúng tôi giả định rằng 15 mô-đun này là nguồn dấu ấn sinh học CSF có nguồn gốc từ não AD có năng suất cao.
Chúng tôi đã gấp 15 mô-đun chồng chéo này thành năm bảng protein lớn dựa trên mức độ gần nhau của chúng trong sơ đồ cây WGCNA và mối liên hệ của chúng với các loại tế bào và bản thể gen (Hình 4D). Bảng đầu tiên chứa các mô-đun giàu dấu hiệu nơ-ron và các protein liên quan đến khớp thần kinh (M1 và M12). Bảng điều khiển khớp thần kinh chứa tổng cộng 94 protein và mức độ trong hệ protein CSF đã thay đổi đáng kể, khiến nó trở thành nguồn đánh dấu CSF liên quan đến não lớn nhất trong số năm bảng. Nhóm thứ hai (M6 và M15) chứng minh mối liên hệ chặt chẽ giữa các dấu hiệu tế bào nội mô và thân mạch, chẳng hạn như “chữa lành vết thương” (M6) và “điều hòa phản ứng miễn dịch dịch thể” (M15). M15 cũng liên quan nhiều đến chuyển hóa lipoprotein, liên quan chặt chẽ đến nội mô (36). Bảng mạch chứa 34 điểm đánh dấu CSF liên quan đến não. Nhóm thứ ba bao gồm các mô-đun (M2 và M4) có liên quan đáng kể đến các dấu hiệu tế bào ít nhánh và sự tăng sinh tế bào. Ví dụ, các thuật ngữ bản thể học cấp cao nhất của M2 bao gồm “sự điều hòa tích cực của quá trình sao chép DNA” và “quá trình sinh tổng hợp purine”. Trong khi đó, M4 bao gồm “sự biệt hóa tế bào thần kinh đệm” và “sự phân chia nhiễm sắc thể”. Bảng myelin hóa chứa 49 điểm đánh dấu CSF liên quan đến não.
Nhóm thứ tư chứa nhiều mô-đun nhất (M30, M29, M18, M24 và M5) và hầu hết tất cả các mô-đun đều giàu đáng kể các dấu hiệu microglia và tế bào hình sao. Tương tự như bảng myelin hóa, bảng thứ tư cũng chứa các mô-đun (M30, M29 và M18) có liên quan chặt chẽ đến sự tăng sinh tế bào. Các học phần khác trong nhóm này có liên quan nhiều đến các thuật ngữ miễn dịch học, chẳng hạn như “quá trình tác động miễn dịch” (M5) và “điều hòa đáp ứng miễn dịch” (M24). Nhóm miễn dịch thần kinh đệm chứa 42 dấu hiệu CSF liên quan đến não. Cuối cùng, bảng cuối cùng bao gồm 52 điểm đánh dấu liên quan đến não trên bốn mô-đun (M44, M3, M33 và M38), tất cả đều nằm trên cơ thể liên quan đến việc lưu trữ và chuyển hóa năng lượng. Mô-đun lớn nhất trong số này (M3) có liên quan chặt chẽ với ty thể và rất giàu các dấu hiệu đặc hiệu cho tế bào thần kinh. M38 là một trong những thành viên mô-đun nhỏ hơn trong hệ chuyển hóa này và cũng thể hiện tính đặc hiệu tế bào thần kinh vừa phải.
Nhìn chung, năm bảng này phản ánh một loạt các loại tế bào và chức năng trong vỏ não AD và chứa chung 271 dấu hiệu CSF liên quan đến não (Bảng S2G). Để đánh giá tính hợp lệ của các kết quả MS này, chúng tôi đã sử dụng xét nghiệm mở rộng vùng lân cận (PEA), một công nghệ dựa trên kháng thể trực giao với khả năng ghép kênh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời phân tích lại các mẫu dịch não tủy mà chúng tôi đã tìm thấy. Một tập hợp con trong số 271 dấu ấn sinh học này (n = 36). 36 mục tiêu này chứng minh sự thay đổi trong bội số AD của PEA, có liên quan chặt chẽ với các phát hiện dựa trên MS của chúng tôi (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), Điều này đã xác minh mạnh mẽ kết quả phân tích MS toàn diện của chúng tôi (Hình S4 ).
Các chủ đề sinh học được năm nhóm của chúng tôi nhấn mạnh, từ tín hiệu khớp thần kinh đến chuyển hóa năng lượng, đều liên quan đến cơ chế bệnh sinh của AD (1-3). Do đó, tất cả 15 mô-đun chứa các bảng này đều liên quan đến bệnh lý AD trong hệ protein não mà chúng tôi đã phát hiện ra (Hình 2B). Đáng chú ý nhất là mối tương quan bệnh lý tích cực cao giữa các mô-đun thần kinh đệm của chúng tôi và mối tương quan bệnh lý tiêu cực mạnh mẽ giữa các mô-đun nơ-ron lớn nhất của chúng tôi (M1 và M3). Phân tích biểu hiện khác biệt của hệ protein não được sao chép của chúng tôi (Hình S3D) cũng làm nổi bật các protein thần kinh đệm có nguồn gốc từ M5 và M18. Trong AsymAD và AD có triệu chứng, protein thần kinh đệm tăng nhiều nhất và các khớp thần kinh liên quan đến M1 Protein bị giảm nhiều nhất. Những quan sát này chỉ ra rằng 271 dấu hiệu dịch não tủy mà chúng tôi xác định được trong năm nhóm có liên quan đến quá trình bệnh ở vỏ não AD, bao gồm cả những dấu hiệu xảy ra ở giai đoạn đầu không có triệu chứng.
Để phân tích tốt hơn hướng thay đổi của các protein bảng trong não và dịch tủy sống, chúng tôi đã vẽ ra những điều sau đây cho từng mô-đun trong số 15 mô-đun chồng chéo: (i) tìm thấy mức độ phong phú của mô-đun trong bộ dữ liệu não và (ii) mô-đun protein Sự khác biệt được thể hiện trong dịch não tủy (Hình S5). Như đã đề cập trước đó, WGCNA được sử dụng để xác định mức độ phong phú của mô-đun hoặc giá trị protein đặc trưng trong não (13). Bản đồ núi lửa được sử dụng để mô tả sự biểu hiện khác biệt của protein mô-đun trong dịch não tủy (AD/control). Những số liệu này cho thấy ba trong số năm bảng cho thấy các xu hướng biểu hiện khác nhau trong não và dịch tủy sống. Hai mô-đun của bảng khớp thần kinh (M1 và M12) cho thấy mức độ phong phú trong não AD giảm đi, nhưng trùng lặp đáng kể với lượng protein tăng lên trong AD CSF (Hình S5A). Các mô-đun liên quan đến tế bào thần kinh có chứa chất chuyển hóa (M3 và M38) cho thấy các kiểu biểu hiện dịch não và dịch não tủy tương tự không nhất quán (Hình S5E). Bảng mạch cũng cho thấy các xu hướng biểu hiện khác nhau, mặc dù các mô-đun của nó (M6 và M15) tăng vừa phải trong não AD và giảm trong CSF bị bệnh (Hình S5B). Hai bảng còn lại chứa các mạng lưới thần kinh đệm lớn có protein được điều chỉnh tăng liên tục trong cả hai ngăn (Hình S5, C và D).
Xin lưu ý rằng những xu hướng này không phổ biến đối với tất cả các điểm đánh dấu trong các bảng này. Ví dụ, bảng điều khiển khớp thần kinh bao gồm một số protein được giảm đáng kể trong não AD và CSF (Hình S5A). Trong số các chất đánh dấu dịch não tủy được điều hòa giảm này có NPTX2 và VGF của M1, và chromogranin B của M12. Tuy nhiên, bất chấp những ngoại lệ này, hầu hết các dấu hiệu khớp thần kinh của chúng tôi đều tăng trong dịch tủy sống AD. Nhìn chung, những phân tích này có thể phân biệt các xu hướng có ý nghĩa thống kê về mức độ não và dịch não tủy ở mỗi bảng trong số năm bảng của chúng tôi. Những xu hướng này nêu bật mối quan hệ phức tạp và thường khác nhau giữa biểu hiện protein não và CSF trong AD.
Sau đó, chúng tôi đã sử dụng phân tích sao chép MS thông lượng cao (sao chép CSF 1) để thu hẹp bộ dấu ấn sinh học 271 của chúng tôi cho các mục tiêu có triển vọng và có thể tái tạo nhất (Hình 5A). Bản sao CSF 1 chứa tổng cộng 96 mẫu từ Emory Goizueta ADRC, bao gồm nhóm đối chứng, AsymAD và AD (Bảng S1A). Những trường hợp AD này được đặc trưng bởi sự suy giảm nhận thức nhẹ (MoCA trung bình, 20,0 ± 3,8) và những thay đổi về dấu ấn sinh học AD được xác nhận trong dịch não tủy (Bảng S1A). Trái ngược với phân tích CSF mà chúng tôi đã tìm thấy, quá trình sao chép này được thực hiện bằng phương pháp MS “một lần bắn” hiệu quả và thông lượng cao hơn (không phân đoạn ngoại tuyến), bao gồm một giao thức chuẩn bị mẫu đơn giản hóa giúp loại bỏ nhu cầu suy giảm miễn dịch của từng mẫu . Thay vào đó, một “kênh tăng cường” miễn dịch bị suy giảm duy nhất được sử dụng để khuếch đại tín hiệu của các protein ít phong phú hơn (37). Mặc dù nó làm giảm phạm vi bao phủ tổng thể của protein, nhưng phương pháp bắn một lần này giúp giảm đáng kể thời gian chạy máy và tăng số lượng mẫu được gắn nhãn TMT có thể được phân tích khả thi (17, 38). Tổng cộng, phân tích đã xác định được 6.487 peptide, ánh xạ tới 1.183 protein trong 96 trường hợp. Như với phân tích CSF mà chúng tôi đã tìm thấy, chỉ những protein được định lượng trong ít nhất 50% số mẫu mới được đưa vào các tính toán tiếp theo và dữ liệu được hồi quy về ảnh hưởng của tuổi tác và giới tính. Điều này dẫn đến việc định lượng cuối cùng 792 protein, 95% trong số đó cũng được xác định trong bộ dữ liệu CSF được tìm thấy.
(A) Các mục tiêu protein CSF liên quan đến não đã được xác minh trong đoàn hệ CSF được sao chép đầu tiên và được đưa vào bảng cuối cùng (n = 60). (B đến E) Mức dấu ấn sinh học của bảng điều khiển (điểm z tổng hợp) được đo trong bốn nhóm sao chép CSF. Các bài kiểm tra t được ghép nối hoặc ANOVA với hiệu chỉnh sau của Tukey đã được sử dụng để đánh giá ý nghĩa thống kê của những thay đổi về mức độ phong phú trong mỗi phân tích lặp lại. CT, kiểm soát.
Vì chúng tôi đặc biệt quan tâm đến việc xác minh 271 mục tiêu CSF liên quan đến não thông qua phân tích toàn diện, chúng tôi sẽ hạn chế kiểm tra thêm về hệ protein được sao chép này đối với các dấu hiệu này. Trong số 271 protein này, 100 protein đã được phát hiện trong quá trình sao chép CSF 1. Hình S6A cho thấy biểu thức khác biệt của 100 điểm chồng chéo này giữa các mẫu sao chép đối chứng và AD. Các histone synap và chất chuyển hóa tăng nhiều nhất trong AD, trong khi protein mạch máu giảm nhiều nhất trong bệnh. Hầu hết trong số 100 điểm đánh dấu chồng chéo (n = 70) duy trì cùng hướng thay đổi trong hai bộ dữ liệu (Hình S6B). 70 dấu hiệu CSF liên quan đến não đã được xác thực này (Bảng S2H) phần lớn phản ánh xu hướng biểu hiện bảng được quan sát trước đó, nghĩa là sự điều chỉnh giảm của protein mạch máu và sự điều chỉnh tăng của tất cả các bảng khác. Chỉ 10 trong số 70 protein được xác nhận này cho thấy những thay đổi về mức độ phong phú của AD trái ngược với các xu hướng này. Để tạo ra bảng phản ánh tốt nhất xu hướng chung của não và dịch não tủy, chúng tôi đã loại 10 protein này khỏi bảng quan tâm mà cuối cùng chúng tôi đã xác minh (Hình 5A). Do đó, hội thảo của chúng tôi cuối cùng bao gồm tổng cộng 60 protein được xác minh trong hai nhóm CSF AD độc lập bằng cách sử dụng quá trình chuẩn bị mẫu và phân tích nền tảng MS khác nhau. Biểu đồ biểu thức điểm z của các bảng cuối cùng này trong trường hợp điều khiển CSF sao chép 1 và AD đã xác nhận xu hướng bảng được quan sát thấy trong đoàn hệ CSF mà chúng tôi đã tìm thấy (Hình 5B).
Trong số 60 protein này, có những phân tử được biết là có liên quan đến AD, chẳng hạn như Osteopontin (SPP1), một cytokine gây viêm có liên quan đến AD trong nhiều nghiên cứu (39-41) và GAP43, Một protein khớp thần kinh điều đó rõ ràng có liên quan đến sự thoái hóa thần kinh (42). Các protein được xác minh đầy đủ nhất là các dấu hiệu liên quan đến các bệnh thoái hóa thần kinh khác, chẳng hạn như superoxide effutase 1 (SOD1) liên quan đến bệnh xơ cứng teo cơ (ALS) và desaccharase liên quan đến bệnh Parkinson (PARK7) . Chúng tôi cũng đã xác minh rằng nhiều dấu hiệu khác, chẳng hạn như SMOC1 và protein tín hiệu gắn màng giàu não 1 (BASP1), đã hạn chế các liên kết trước đây với thoái hóa thần kinh. Điều đáng chú ý là do mức độ phong phú tổng thể thấp trong hệ protein CSF, chúng tôi khó sử dụng phương pháp phát hiện một lần bắn thông lượng cao này để phát hiện MAPT và một số protein liên quan đến AD khác một cách đáng tin cậy (ví dụ: NEFL và NRGN). ) ( 43, 44).
Sau đó, chúng tôi đã kiểm tra 60 điểm đánh dấu bảng ưu tiên này trong ba phân tích lặp lại bổ sung. Trong CSF Copy 2, chúng tôi đã sử dụng một TMT-MS duy nhất để phân tích một nhóm độc lập gồm 297 mẫu kiểm soát và AD từ Emory Goizueta ADRC (17). Sao chép CSF 3 bao gồm phân tích lại dữ liệu TMT-MS có sẵn từ 120 bệnh nhân đối chứng và AD từ Lausanne, Thụy Sĩ (45). Chúng tôi đã phát hiện hơn 2/3 trong số 60 điểm đánh dấu ưu tiên trong mỗi tập dữ liệu. Mặc dù nghiên cứu của Thụy Sĩ sử dụng các nền tảng MS và phương pháp định lượng TMT khác nhau (45, 46), chúng tôi đã tái tạo mạnh mẽ xu hướng bảng trong hai phân tích lặp lại (Hình 5, C và D và Bảng S2, I và J). Để đánh giá tính đặc hiệu của bệnh trong nhóm của chúng tôi, chúng tôi đã sử dụng TMT-MS để phân tích tập dữ liệu sao chép thứ tư (bản sao CSF 4), không chỉ bao gồm các trường hợp kiểm soát (n = 18) và AD (n = 17), mà còn cả PD ( n = 14)), mẫu ALS (n = 18) và mẫu mất trí nhớ trán-thái dương (FTD) (n = 11) (Bảng S1A). Chúng tôi đã định lượng thành công gần 2/3 số protein trong nhóm này (38 trên 60). Những kết quả này nêu bật những thay đổi cụ thể về AD trong cả năm bảng dấu ấn sinh học (Hình 5E và Bảng S2K). Sự gia tăng nhóm chất chuyển hóa cho thấy tính đặc hiệu AD mạnh nhất, tiếp theo là nhóm myelin hóa và nhóm thần kinh đệm. Ở mức độ thấp hơn, FTD cũng cho thấy sự gia tăng giữa các bảng này, điều này có thể phản ánh những thay đổi tiềm năng tương tự của mạng (17). Ngược lại, ALS và PD cho thấy các cấu hình myelin hóa, thần kinh đệm và chuyển hóa gần như giống như nhóm đối chứng. Nhìn chung, mặc dù có sự khác biệt trong cách chuẩn bị mẫu, nền tảng MS và phương pháp định lượng TMT, những phân tích lặp lại này cho thấy các điểm đánh dấu bảng ưu tiên của chúng tôi có những thay đổi cụ thể về AD có tính nhất quán cao trong hơn 500 mẫu CSF duy nhất.
Sự thoái hóa thần kinh AD đã được công nhận rộng rãi vài năm trước khi xuất hiện các triệu chứng nhận thức, do đó, nhu cầu cấp thiết về dấu ấn sinh học của AsymAD (5, 31). Tuy nhiên, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sinh học của AsymAD không đồng nhất và sự tương tác phức tạp giữa rủi ro và khả năng phục hồi dẫn đến sự khác biệt lớn ở mỗi cá nhân trong quá trình phát triển bệnh tiếp theo (47). Mặc dù được sử dụng để xác định các trường hợp AsymAD, mức độ của dấu ấn sinh học CSF cốt lõi (Aβ1-42, tổng tau và p-tau) chưa được chứng minh là có thể dự đoán một cách đáng tin cậy ai sẽ tiến triển thành chứng mất trí nhớ (4, 7), cho thấy nhiều hơn. cần thiết phải bao gồm các công cụ đánh dấu sinh học toàn diện dựa trên nhiều khía cạnh của sinh lý não để phân loại chính xác nguy cơ của nhóm đối tượng này. Do đó, sau đó, chúng tôi đã phân tích bảng dấu ấn sinh học đã được AD xác thực trong quần thể AsymAD của bản sao CSF 1. 31 trường hợp AsymAD này cho thấy mức dấu ấn sinh học cốt lõi bất thường (tỷ lệ ELISA Aβ1–42/tổng tau, <5,5) và nhận thức hoàn chỉnh (trung bình MoCA, 27,1 ± 2.2) (Bảng S1A). Ngoài ra, tất cả những người mắc AsymAD đều có điểm sa sút trí tuệ lâm sàng là 0, cho thấy không có bằng chứng nào về sự suy giảm hiệu suất nhận thức hoặc chức năng hàng ngày.
Trước tiên, chúng tôi đã phân tích mức độ của các bảng được xác thực trong tất cả 96 bản sao CSF 1, bao gồm cả nhóm AsymAD. Chúng tôi nhận thấy rằng một số bảng trong nhóm AsymAD có những thay đổi đáng kể về độ phong phú giống như AD, bảng mạch cho thấy xu hướng giảm trong AsymAD, trong khi tất cả các bảng khác cho thấy xu hướng tăng (Hình 6A). Do đó, tất cả các bảng đều cho thấy mối tương quan rất đáng kể với ELISA Aβ1-42 và tổng mức tau (Hình 6B). Ngược lại, mối tương quan giữa nhóm và điểm MoCA tương đối kém. Một trong những phát hiện nổi bật hơn từ những phân tích này là sự phong phú của bảng điều khiển trong đoàn hệ AsymAD. Như được hiển thị trong Hình 6A, cấp độ bảng điều khiển của nhóm AsymAD thường vượt qua cấp độ bảng điều khiển của nhóm kiểm soát và nhóm AD, cho thấy mức độ biến thiên tương đối cao. Để khám phá thêm về tính không đồng nhất này của AsymAD, chúng tôi đã áp dụng phân tích Chia tỷ lệ đa chiều (MDS) cho 96 trường hợp sao chép CSF 1. Phân tích MDS cho phép hình dung sự giống nhau giữa các trường hợp dựa trên các biến nhất định trong tập dữ liệu. Đối với phân tích cụm này, chúng tôi chỉ sử dụng các điểm đánh dấu bảng đã được xác thực có thay đổi có ý nghĩa thống kê (P <0, 05, AD/điều khiển) ở cấp độ phát hiện và sao chép CSF 1 proteome (n = 29) (Bảng S2L). Phân tích này tạo ra sự phân cụm không gian rõ ràng giữa các trường hợp kiểm soát và AD của chúng tôi (Hình 6C). Ngược lại, một số trường hợp AsymAD được phân nhóm rõ ràng trong nhóm đối chứng, trong khi những trường hợp khác nằm trong các trường hợp AD. Để khám phá thêm về tính không đồng nhất AsymAD này, chúng tôi đã sử dụng bản đồ MDS của mình để xác định hai nhóm trường hợp AsymAD này. Nhóm đầu tiên bao gồm các trường hợp AsymAD được nhóm gần với nhóm đối chứng hơn (n = 19), trong khi nhóm thứ hai được đặc trưng bởi các trường hợp AsymAD có cấu hình điểm đánh dấu gần với AD hơn (n = 12).
( A ) Mức biểu hiện (z-score) của nhóm dấu ấn sinh học CSF trong tất cả 96 mẫu trong đoàn hệ sao chép CSF 1, bao gồm cả AsymAD. Phân tích phương sai với hiệu chỉnh sau của Tukey đã được sử dụng để đánh giá ý nghĩa thống kê của những thay đổi về độ phong phú của bảng. (B) Phân tích tương quan giữa mức độ phong phú protein trong bảng (điểm z) với điểm MoCA và tổng mức tau trong mẫu ELISA Aβ1-42 và bản sao CSF 1. Hệ số tương quan Pearson với giá trị P liên quan được hiển thị. (C) MDS của 96 trường hợp CSF sao chép 1 dựa trên mức độ phong phú của 29 điểm đánh dấu bảng đã được xác thực, đã được thay đổi đáng kể trong cả bộ dữ liệu khám phá và bản sao CSF 1 [P <0,05 AD/điều khiển (CT)]. Phân tích này được sử dụng để chia nhóm AsymAD thành các nhóm con kiểm soát (n = 19) và AD (n = 12). (D) Sơ đồ núi lửa cho thấy sự biểu hiện khác biệt của tất cả các protein sao chép CSF 1 với sự thay đổi lần log2 (trục x) so với giá trị P thống kê -log10 giữa hai nhóm con AsymAD. Các dấu ấn sinh học của bảng điều khiển có màu. (E) Mức độ sao chép CSF 1 của các dấu ấn sinh học trong nhóm chọn lọc được thể hiện khác nhau giữa các nhóm con AsymAD. Phân tích phương sai sau điều chỉnh của Tukey được sử dụng để đánh giá ý nghĩa thống kê.
Chúng tôi đã kiểm tra biểu hiện protein khác biệt giữa các trường hợp kiểm soát này và các trường hợp AsymAD giống AD (Hình 6D và Bảng S2L). Bản đồ núi lửa thu được cho thấy 14 điểm đánh dấu trên bảng đã thay đổi đáng kể giữa hai nhóm. Hầu hết các dấu hiệu này là thành viên của khớp thần kinh và bộ chuyển hóa. Tuy nhiên, SOD1 và chất nền protein kinase C giàu alanine alanine (MARCKS), lần lượt là thành viên của nhóm miễn dịch myelin và thần kinh đệm, cũng thuộc nhóm này (Hình 6, D và E) . Bảng điều khiển mạch máu cũng đóng góp hai dấu hiệu được giảm đáng kể trong nhóm AsymAD giống AD, bao gồm protein liên kết AE 1 (AEBP1) và thành viên họ bổ sung C9. Không có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm đối chứng và nhóm phụ AsymAD giống AD trong ELISA AB1-42 (P = 0,38) và p-tau (P = 0,28), nhưng thực sự có sự khác biệt đáng kể về tổng mức tau (P = 0,0031 ) (Hình S7). Có một số điểm đánh dấu bảng chỉ ra rằng những thay đổi giữa hai nhóm con AsymAD có ý nghĩa hơn so với tổng mức tau (ví dụ: YWHAZ, SOD1 và MDH1) (Hình 6E). Nhìn chung, những kết quả này chỉ ra rằng bảng được xác nhận của chúng tôi có thể chứa các dấu ấn sinh học có thể phân loại và phân tầng nguy cơ tiềm ẩn ở những bệnh nhân mắc bệnh không có triệu chứng.
Có nhu cầu cấp thiết về các công cụ đánh dấu sinh học dựa trên hệ thống để đo lường và nhắm mục tiêu tốt hơn vào sinh lý bệnh khác nhau đằng sau AD. Những công cụ này được kỳ vọng sẽ không chỉ thay đổi khung chẩn đoán AD của chúng tôi mà còn thúc đẩy việc áp dụng các chiến lược điều trị hiệu quả, dành riêng cho từng bệnh nhân (1, 2). Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã áp dụng phương pháp tiếp cận protein toàn diện không thiên vị cho não AD và CSF để xác định các dấu ấn sinh học CSF dựa trên web phản ánh một loạt sinh lý bệnh dựa trên não. Phân tích của chúng tôi đã tạo ra năm bảng dấu ấn sinh học CSF, trong đó (i) phản ánh các khớp thần kinh, mạch máu, myelin, rối loạn chức năng miễn dịch và trao đổi chất; (ii) thể hiện khả năng tái tạo mạnh mẽ trên các nền tảng MS khác nhau; ( iii) Hiển thị những thay đổi tiến triển theo từng bệnh cụ thể trong suốt giai đoạn đầu và cuối của AD. Nhìn chung, những phát hiện này thể hiện một bước đi đầy hứa hẹn hướng tới việc phát triển các công cụ đánh dấu sinh học đa dạng, đáng tin cậy, hướng tới web cho nghiên cứu AD và ứng dụng lâm sàng.
Kết quả của chúng tôi chứng minh tổ chức được bảo tồn cao của hệ protein mạng não AD và hỗ trợ việc sử dụng nó như một điểm tựa cho sự phát triển dấu ấn sinh học dựa trên hệ thống. Phân tích của chúng tôi cho thấy hai bộ dữ liệu TMT-MS độc lập chứa bộ não AD và AsymAD có tính mô đun hóa mạnh mẽ. Những phát hiện này mở rộng công việc trước đây của chúng tôi, chứng minh việc bảo tồn các mô-đun mạnh mẽ của hơn 2.000 mô não từ nhiều nhóm độc lập ở vỏ não trán, đỉnh và thái dương (17). Mạng lưới đồng thuận này phản ánh những thay đổi khác nhau liên quan đến bệnh tật được quan sát thấy trong nghiên cứu hiện tại, bao gồm sự gia tăng các mô-đun viêm giàu thần kinh đệm và giảm các mô-đun giàu tế bào thần kinh. Giống như nghiên cứu hiện tại, mạng lưới quy mô lớn này cũng có những thay đổi mô-đun đáng kể trong AsymAD, cho thấy nhiều loại sinh lý bệnh tiền lâm sàng khác nhau (17).
Tuy nhiên, trong khuôn khổ dựa trên hệ thống có tính bảo thủ cao này, có sự không đồng nhất về mặt sinh học ở mức độ chi tiết hơn, đặc biệt là giữa các cá nhân ở giai đoạn đầu của AD. Bảng dấu ấn sinh học của chúng tôi có thể mô tả hai nhóm con trong AsymAD, thể hiện sự biểu hiện khác biệt đáng kể của nhiều dấu hiệu CSF. Nhóm của chúng tôi đã có thể nêu bật những khác biệt sinh học giữa hai nhóm nhỏ này, những khác biệt này không rõ ràng ở cấp độ dấu ấn sinh học AD cốt lõi. So với nhóm đối chứng, tỷ lệ Aβ1-42/tổng tau của những cá thể AsymAD này thấp bất thường. Tuy nhiên, chỉ có tổng mức tau là khác nhau đáng kể giữa hai phân nhóm AsymAD, trong khi mức Aβ1-42 và p-tau vẫn tương đối giống nhau. Vì tau CSF cao dường như là yếu tố dự báo tốt hơn về các triệu chứng nhận thức so với mức Aβ1-42 (7), chúng tôi nghi ngờ rằng hai nhóm AsymAD có thể có nguy cơ tiến triển bệnh khác nhau. Với kích thước mẫu hạn chế của AsymAD của chúng tôi và thiếu dữ liệu theo chiều dọc, cần nghiên cứu thêm để tự tin đưa ra kết luận này. Tuy nhiên, những kết quả này chỉ ra rằng bảng CSF dựa trên hệ thống có thể nâng cao khả năng phân tầng các cá nhân một cách hiệu quả trong giai đoạn không có triệu chứng của bệnh.
Nhìn chung, những phát hiện của chúng tôi ủng hộ vai trò của nhiều chức năng sinh học trong cơ chế bệnh sinh của AD. Tuy nhiên, quá trình chuyển hóa năng lượng không được điều hòa đã trở thành chủ đề nổi bật trong tất cả năm bảng ghi nhãn đã được xác nhận của chúng tôi. Các protein chuyển hóa, chẳng hạn như hypoxanthine-guanine photphoribosyltransferase 1 (HPRT1) và lactate dehydrogenase A (LDHA), là những dấu ấn sinh học khớp thần kinh được xác nhận mạnh mẽ nhất, cho thấy rằng sự gia tăng AD CSF là khả năng sinh sản cao. Các mạch máu và tấm thần kinh đệm của chúng ta cũng chứa một số dấu hiệu liên quan đến quá trình chuyển hóa các chất oxy hóa. Những phát hiện này phù hợp với vai trò quan trọng của các quá trình trao đổi chất trong toàn bộ não, không chỉ đáp ứng nhu cầu năng lượng cao của tế bào thần kinh mà còn đáp ứng nhu cầu năng lượng cao của tế bào hình sao và các tế bào thần kinh đệm khác (17, 48). Kết quả của chúng tôi hỗ trợ bằng chứng ngày càng tăng rằng những thay đổi về tiềm năng oxy hóa khử và sự gián đoạn của các con đường năng lượng có thể là mối liên kết cốt lõi giữa một số quá trình chính liên quan đến sinh bệnh học của AD, bao gồm rối loạn ty thể, viêm qua trung gian thần kinh đệm và tổn thương mạch máu (49). Ngoài ra, các dấu ấn sinh học dịch não tủy chuyển hóa có chứa một số lượng lớn các protein giàu khác nhau giữa các nhóm AsymAD kiểm soát của chúng tôi và giống như AD, cho thấy rằng sự gián đoạn của các con đường năng lượng và oxy hóa khử này có thể rất quan trọng trong giai đoạn tiền lâm sàng của bệnh .
Các xu hướng khác nhau của bảng não và dịch não tủy mà chúng tôi quan sát được cũng có những ý nghĩa sinh học thú vị. Các khớp thần kinh và các chất chuyển hóa giàu tế bào thần kinh cho thấy mức độ giảm trong não AD và tăng lượng dịch não tủy. Cho rằng các tế bào thần kinh rất giàu ty thể sản xuất năng lượng ở các khớp thần kinh để cung cấp năng lượng cho nhiều tín hiệu chuyên biệt của chúng (50), nên sự giống nhau về cấu hình biểu hiện của hai nhóm tế bào thần kinh này được mong đợi. Việc mất tế bào thần kinh và sự bong ra của các tế bào bị tổn thương có thể giải thích những xu hướng này của não và bảng CSF trong bệnh sau này, nhưng chúng không thể giải thích những thay đổi ban đầu mà chúng tôi quan sát được (13). Một lời giải thích khả dĩ cho những phát hiện này ở bệnh không có triệu chứng sớm là việc cắt tỉa khớp thần kinh bất thường. Bằng chứng mới trên mô hình chuột cho thấy quá trình thực bào khớp thần kinh qua trung gian microglia có thể được kích hoạt bất thường trong AD và dẫn đến mất khớp thần kinh sớm trong não (51). Vật liệu khớp thần kinh bị loại bỏ này có thể tích lũy trong CSF, đó là lý do tại sao chúng tôi quan sát thấy sự gia tăng CSF trong bảng nơ-ron. Việc cắt tỉa khớp thần kinh qua trung gian miễn dịch cũng có thể giải thích một phần sự gia tăng protein thần kinh đệm mà chúng ta quan sát thấy trong não và dịch não tủy trong suốt quá trình bệnh. Ngoài việc cắt tỉa khớp thần kinh, những bất thường tổng thể trong con đường ngoại bào cũng có thể dẫn đến các biểu hiện não và CSF khác nhau của các dấu hiệu thần kinh. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng exosome trong cơ chế bệnh sinh của não AD đã thay đổi (52). Con đường ngoại bào cũng liên quan đến sự tăng sinh của Aβ (53, 54). Điều đáng chú ý là việc ức chế bài tiết ngoại bào có thể làm giảm bệnh lý giống AD ở mô hình chuột biến đổi gen AD (55).
Đồng thời, protein trong bảng mạch máu cho thấy sự gia tăng vừa phải ở não AD nhưng lại giảm đáng kể ở CSF. Rối loạn chức năng hàng rào máu não (BBB) có thể giải thích phần nào những phát hiện này. Nhiều nghiên cứu độc lập trên người sau khi chết đã chứng minh sự phân hủy BBB trong AD (56, 57). Những nghiên cứu này đã xác nhận các hoạt động bất thường khác nhau xung quanh lớp tế bào nội mô bịt kín này, bao gồm rò rỉ mao mạch não và tích tụ quanh mạch máu các protein truyền qua máu (57). Điều này có thể đưa ra lời giải thích đơn giản về lượng protein mạch máu tăng cao trong não, nhưng nó không thể giải thích đầy đủ sự cạn kiệt của các protein tương tự này trong dịch não tủy. Một khả năng là hệ thống thần kinh trung ương đang tích cực cô lập các phân tử này để giải quyết vấn đề gia tăng tình trạng viêm và stress oxy hóa. Việc giảm một số protein CSF nghiêm trọng nhất trong bảng này, đặc biệt là những protein liên quan đến điều hòa lipoprotein, có liên quan đến việc ức chế mức độ viêm có hại và quá trình bảo vệ thần kinh của các loại oxy phản ứng. Điều này đúng với Paroxonase 1 (PON1), một enzyme liên kết với lipoprotein chịu trách nhiệm giảm mức độ căng thẳng oxy hóa trong tuần hoàn (58, 59). Tiền chất Alpha-1-microglobulin/bikunin (AMBP) là một dấu hiệu khác được điều chỉnh giảm đáng kể của nhóm mạch máu. Nó là tiền chất của bikunin vận chuyển lipid, chất này cũng tham gia vào việc ức chế viêm và bảo vệ thần kinh (60, 61).
Mặc dù có nhiều giả thuyết thú vị khác nhau, việc không thể phát hiện trực tiếp các cơ chế bệnh sinh hóa là một hạn chế nổi tiếng của phân tích proteomics dựa trên khám phá. Do đó, cần nghiên cứu sâu hơn để xác định một cách chắc chắn các cơ chế đằng sau các tấm dấu ấn sinh học này. Để tiến tới phát triển phân tích lâm sàng dựa trên MS, định hướng tương lai cũng yêu cầu sử dụng các phương pháp định lượng có mục tiêu để xác minh dấu ấn sinh học quy mô lớn, chẳng hạn như theo dõi phản ứng chọn lọc hoặc song song (62). Gần đây chúng tôi đã sử dụng phương pháp theo dõi phản ứng song song (63) để xác nhận nhiều thay đổi về protein CSF được mô tả ở đây. Một số mục tiêu của bảng ưu tiên được định lượng với độ chính xác đáng kể, bao gồm YWHAZ, ALDOA và SMOC1, lần lượt ánh xạ tới các khớp thần kinh, trao đổi chất và bảng viêm của chúng ta (63). Thu thập dữ liệu độc lập (DIA) và các chiến lược dựa trên MS khác cũng có thể hữu ích cho việc xác minh mục tiêu. Bud và cộng sự. (64) Gần đây người ta đã chứng minh rằng có sự trùng lặp đáng kể giữa các dấu ấn sinh học AD được xác định trong bộ dữ liệu khám phá CSF của chúng tôi và bộ dữ liệu DIA-MS độc lập, bao gồm gần 200 mẫu CSF từ ba đoàn hệ châu Âu khác nhau. Những nghiên cứu gần đây này hỗ trợ tiềm năng của bảng của chúng tôi trong việc chuyển đổi thành khả năng phát hiện dựa trên MS đáng tin cậy. Việc phát hiện dựa trên kháng thể và aptamer truyền thống cũng rất quan trọng để phát triển hơn nữa các dấu ấn sinh học chính của AD. Do lượng CSF dồi dào nên việc phát hiện các dấu ấn sinh học này bằng phương pháp MS thông lượng cao sẽ khó khăn hơn. NEFL và NRGN là hai ví dụ về dấu ấn sinh học CSF có độ phong phú thấp, được ánh xạ tới bảng điều khiển trong phân tích toàn diện của chúng tôi, nhưng không thể được phát hiện một cách đáng tin cậy bằng chiến lược MS duy nhất của chúng tôi. Các chiến lược nhắm mục tiêu dựa trên nhiều kháng thể, chẳng hạn như PEA, có thể thúc đẩy sự chuyển đổi lâm sàng của các dấu hiệu này.
Nhìn chung, nghiên cứu này cung cấp một cách tiếp cận proteomics độc đáo để xác định và xác minh các dấu ấn sinh học CSF AD dựa trên các hệ thống khác nhau. Việc tối ưu hóa các bảng đánh dấu này trên các nhóm AD bổ sung và nền tảng MS có thể tỏ ra đầy hứa hẹn sẽ thúc đẩy việc phân loại và xử lý rủi ro AD. Các nghiên cứu đánh giá mức độ theo chiều dọc của các bảng này theo thời gian cũng rất quan trọng để xác định sự kết hợp nào của các dấu hiệu phân tầng tốt nhất nguy cơ mắc bệnh sớm và những thay đổi về mức độ nghiêm trọng của bệnh.
Ngoại trừ 3 mẫu được CSF sao chép, tất cả các mẫu CSF được sử dụng trong nghiên cứu này đều được thu thập dưới sự bảo trợ của Emory ADRC hoặc các tổ chức nghiên cứu liên quan chặt chẽ. Tổng cộng có bốn bộ mẫu Emory CSF đã được sử dụng trong các nghiên cứu về protein này. Nhóm thuần tập CSF được phát hiện có chứa các mẫu từ 20 đối chứng khỏe mạnh và 20 bệnh nhân AD. Bản sao CSF 1 bao gồm các mẫu từ 32 đối chứng khỏe mạnh, 31 cá thể AsymAD và 33 cá thể AD. Bản sao CSF 2 chứa 147 điều khiển và 150 mẫu AD. Nhóm thuần tập sao chép CSF đa bệnh 4 bao gồm 18 mẫu đối chứng, 17 mẫu AD, 19 ALS, 13 PD và 11 mẫu FTD. Theo thỏa thuận đã được Hội đồng Đánh giá Thể chế của Đại học Emory phê duyệt, tất cả những người tham gia nghiên cứu của Emory đều nhận được sự đồng ý có hiểu biết. Theo Hướng dẫn Thực hành Tốt nhất của Viện Lão hóa Quốc gia dành cho các Trung tâm Alzheimer năm 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), dịch não tủy được thu thập và lưu trữ bằng cách chọc dò tủy sống. Bệnh nhân Kiểm soát và AsymAD và AD đã được đánh giá nhận thức tiêu chuẩn tại Phòng khám Thần kinh Nhận thức Emory hoặc Goizueta ADRC. Các mẫu dịch não tủy của họ đã được INNO-BIA AlzBio3 Luminex xét nghiệm để phân tích ELISA Aβ1-42, tổng tau và p-tau (65). Các giá trị ELISA được sử dụng để hỗ trợ phân loại chẩn đoán đối tượng dựa trên tiêu chí giới hạn dấu ấn sinh học AD đã được thiết lập (66, 67). Dữ liệu chẩn đoán và nhân khẩu học cơ bản cho các chẩn đoán CSF khác (FTD, ALS và PD) cũng được lấy từ Emory ADRC hoặc các tổ chức nghiên cứu liên kết. Có thể tìm thấy siêu dữ liệu trường hợp tóm tắt cho các trường hợp Emory CSF này trong Bảng S1A. Các đặc điểm của đoàn hệ sao chép CSF Thụy Sĩ 3 đã được công bố trước đây (45).
CSF đã tìm thấy mẫu. Để tăng cường độ sâu khám phá của chúng tôi về tập dữ liệu CSF, việc tiêu thụ miễn dịch các protein có hàm lượng dồi dào cao đã được thực hiện trước khi thử cố gắng. Nói tóm lại, 130 μl CSF từ 40 mẫu CSF riêng lẻ và một thể tích bằng nhau (130 μl) Nhựa suy giảm protein dồi dào Top14 chọn lọc cao (Thermo Fisher Scientific, A36372) được đặt trong cột quay (Thermo Fisher Scientific, A89868) tại phòng nhiệt độ ủ). Sau khi quay 15 phút, ly tâm mẫu ở tốc độ 1000 g trong 2 phút. Một thiết bị lọc siêu ly tâm 3K (Millipore, UFC500396) đã được sử dụng để cô đặc mẫu nước thải bằng cách ly tâm ở tốc độ 14.000 g trong 30 phút. Pha loãng tất cả thể tích mẫu thành 75 µl bằng dung dịch muối đệm photphat. Nồng độ protein được đánh giá bằng phương pháp axit bicinchoninic (BCA) theo quy trình của nhà sản xuất (Thermo Fisher Scientific). CSF bị suy giảm miễn dịch (60 μl) từ tất cả 40 mẫu đã được tiêu hóa bằng lysyl endpeptidase (LysC) và trypsin. Tóm lại, mẫu được khử và alkyl hóa bằng 1,2 μl 0,5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine và 3 μl 0,8 M chloroacetamide ở 90°C trong 10 phút, sau đó siêu âm trong nồi cách thủy trong 15 phút. Mẫu được pha loãng với 193 μl dung dịch đệm urê 8 M [urê 8 M và 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] đến nồng độ cuối cùng là 6 M urê. LysC (4,5 μg; Wako) được sử dụng để tiêu hóa qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, mẫu được pha loãng thành 1 M urê với 50 mM amoni bicarbonate (ABC) (68). Thêm một lượng tương đương (4,5 μg) trypsin (Promega), sau đó ủ mẫu trong 12 giờ. Axit hóa dung dịch peptide đã phân hủy đến nồng độ cuối cùng là 1% axit formic (FA) và 0,1% axit trifluoroacetic (TFA) (66), sau đó khử muối bằng cột Sep-Pak C18 50 mg (Nước) như mô tả ở trên (25) . Peptide sau đó được rửa giải trong 1 ml acetonitril 50% (ACN). Để chuẩn hóa việc định lượng protein theo các lô (25), 100 μl phần dịch từ tất cả 40 mẫu CSF đã được kết hợp để tạo ra một mẫu hỗn hợp, sau đó được chia thành năm mẫu tiêu chuẩn nội bộ toàn cầu (GIS) (48). Tất cả các mẫu riêng lẻ và các chất chuẩn tổng hợp đều được sấy khô bằng chân không tốc độ cao (Labconco).
CSF sao chép mẫu. Dayon và các đồng nghiệp trước đây đã mô tả sự suy giảm miễn dịch và tiêu hóa của 3 mẫu sao chép CSF (45, 46). Các mẫu sao chép còn lại không bị suy giảm miễn dịch riêng lẻ. Tiêu hóa các mẫu chưa được loại bỏ này trong trypsin như đã mô tả trước đây (17). Đối với mỗi phân tích lặp lại, 120 μl phần peptide rửa giải từ mỗi mẫu được gộp lại với nhau và chia thành các phần thể tích bằng nhau để sử dụng làm chất chuẩn nội toàn cầu được gắn nhãn TMT (48). Tất cả các mẫu riêng lẻ và các chất chuẩn tổng hợp đều được sấy khô bằng chân không tốc độ cao (Labconco). Để tăng cường tín hiệu của protein CSF có độ phong phú thấp, bằng cách kết hợp 125 μl từ mỗi mẫu, một mẫu “tăng cường” đã được chuẩn bị cho mỗi lần phân tích lặp lại [tức là một mẫu sinh học bắt chước mẫu nghiên cứu, nhưng số lượng có sẵn là lớn hơn nhiều (37, 69)] được hợp nhất thành mẫu CSF hỗn hợp (17). Sau đó, mẫu hỗn hợp được loại bỏ miễn dịch bằng cách sử dụng 12 ml Nhựa loại bỏ protein dồi dào Top14 chọn lọc cao (Thermo Fisher Scientific, A36372), được tiêu hóa như mô tả ở trên và được đưa vào nhãn TMT nhiều lần tiếp theo.
Thời gian đăng: 27-08-2021