Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Thermophiles là vi sinh vật phát triển mạnh ở nhiệt độ cao. Nghiên cứu chúng có thể cung cấp thông tin có giá trị về cách cuộc sống thích nghi với điều kiện khắc nghiệt. Tuy nhiên, rất khó để đạt được điều kiện nhiệt độ cao bằng kính hiển vi quang học thông thường. Một số giải pháp tự chế dựa trên hệ thống sưởi điện bằng điện trở cục bộ đã được đề xuất nhưng chưa có giải pháp thương mại đơn giản nào. Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu khái niệm đốt nóng bằng laser vi mô trên trường quan sát của kính hiển vi để cung cấp nhiệt độ cao cho các nghiên cứu về vật liệu ưa nhiệt trong khi vẫn giữ cho môi trường của người dùng ở mức ôn hòa. Có thể đạt được nhiệt độ vi mô ở cường độ laser vừa phải bằng cách sử dụng chất nền phủ hạt nano vàng làm chất hấp thụ ánh sáng hiệu quả và tương thích sinh học. Những ảnh hưởng có thể có của sự đối lưu chất lỏng ở quy mô vi mô, khả năng giữ lại tế bào và chuyển động nhiệt ly tâm sẽ được thảo luận. Phương pháp này đã được chứng minh ở hai loài: (i) Geobacillus stearothermophilus, một loại vi khuẩn ưa nhiệt hoạt động sinh sản ở nhiệt độ khoảng 65°C, mà chúng tôi đã quan sát thấy chúng nảy mầm, phát triển và bơi dưới nhiệt độ vi mô; (ii) Thiobacillus sp., vi khuẩn cổ ưa nhiệt tối ưu. ở 80°C. Công trình này mở đường cho việc quan sát đơn giản và an toàn các vi sinh vật ưa nhiệt bằng các công cụ kính hiển vi hiện đại và giá cả phải chăng.
Trải qua hàng tỷ năm, sự sống trên Trái đất đã phát triển để thích nghi với nhiều điều kiện môi trường mà đôi khi được coi là khắc nghiệt theo quan điểm của con người chúng ta. Đặc biệt, một số vi sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn, vi khuẩn cổ, nấm) gọi là vi sinh vật ưa nhiệt phát triển mạnh ở nhiệt độ từ 45°C đến 122°C1, 2, 3, 4. Vi sinh vật ưa nhiệt sống ở nhiều hệ sinh thái khác nhau như miệng phun thủy nhiệt biển sâu, suối nước nóng. hoặc các khu vực núi lửa. Nghiên cứu của họ đã thu hút được nhiều sự quan tâm trong vài thập kỷ qua vì ít nhất hai lý do. Đầu tiên, chúng ta có thể học hỏi từ chúng, ví dụ, làm thế nào các chất ưa nhiệt 5, 6, enzyme 7, 8 và màng 9 ổn định ở nhiệt độ cao như vậy hoặc làm thế nào các chất ưa nhiệt có thể chịu được mức bức xạ cực cao10. Thứ hai, chúng là cơ sở cho nhiều ứng dụng công nghệ sinh học quan trọng1,11,12 như sản xuất nhiên liệu13,14,15,16, tổng hợp hóa học (dihydro, rượu, metan, axit amin, v.v.)17, khai thác sinh học18 và các chất xúc tác sinh học ổn định nhiệt7,11, 13. Đặc biệt, phản ứng chuỗi polymerase (PCR)19 được biết đến rộng rãi hiện nay liên quan đến một enzyme (Taq polymerase) được phân lập từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus Aquas, một trong những vi khuẩn ưa nhiệt đầu tiên được phát hiện.
Tuy nhiên, nghiên cứu về sinh vật ưa nhiệt không phải là một nhiệm vụ dễ dàng và không thể thực hiện được trong bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học nào. Đặc biệt, không thể quan sát được các sinh vật ưa nhiệt sống trong ống nghiệm bằng bất kỳ kính hiển vi ánh sáng tiêu chuẩn nào, ngay cả với các buồng gia nhiệt có bán trên thị trường, thường được đánh giá ở nhiệt độ thấp tới 40°C. Kể từ những năm 1990, chỉ có một số nhóm nghiên cứu quan tâm đến việc giới thiệu hệ thống kính hiển vi nhiệt độ cao (HTM). Năm 1994 Glukh và cộng sự. Buồng sưởi ấm/làm mát được hình thành dựa trên việc sử dụng tế bào Peltier để kiểm soát nhiệt độ của các mao mạch hình chữ nhật đóng lại để duy trì tính kỵ khí 20 . Thiết bị có thể được làm nóng tới 100°C với tốc độ 2°C/s, cho phép các tác giả nghiên cứu khả năng vận động của vi khuẩn ưa nhiệt Thermotoga maritima21. Năm 1999 Horn và cộng sự. Một thiết bị tương tự đã được phát triển, vẫn dựa trên việc sử dụng các mao mạch được làm nóng phù hợp với kính hiển vi thương mại để nghiên cứu sự phân chia/kết nối tế bào. Sau một thời gian dài tương đối không hoạt động, việc tìm kiếm HTM hiệu quả đã được tiếp tục vào năm 2012, đặc biệt liên quan đến một loạt bài báo của nhóm Wirth sử dụng một thiết bị do Horn và cộng sự phát minh. Mười lăm năm trước, khả năng vận động của một số lượng lớn vi khuẩn cổ, bao gồm cả vi khuẩn ưa nhiệt, đã được nghiên cứu ở nhiệt độ lên tới 100°C bằng cách sử dụng các mao mạch được làm nóng23,24. Họ cũng sửa đổi kính hiển vi ban đầu để đạt được tốc độ gia nhiệt nhanh hơn (vài phút thay vì 35 phút để đạt đến nhiệt độ cài đặt) và đạt được độ dốc nhiệt độ tuyến tính hơn 2 cm trên môi trường. Thiết bị định hình gradient nhiệt độ (TGFD) này đã được sử dụng để nghiên cứu tính di động của nhiều chất ưa nhiệt trong gradient nhiệt độ ở khoảng cách liên quan đến sinh học 24, 25.
Làm nóng các mao mạch kín không phải là cách duy nhất để quan sát các sinh vật ưa nhiệt sống. Năm 2012, Kuwabara và cộng sự. Các buồng Pyrex dùng một lần tự chế được dán kín bằng keo chịu nhiệt (Super X2; Cemdine, Nhật Bản) đã được sử dụng. Các mẫu được đặt trên một tấm gia nhiệt trong suốt có bán trên thị trường (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Nhật Bản) có khả năng làm nóng lên đến 110°C, nhưng ban đầu không nhằm mục đích tạo ảnh sinh học. Các tác giả đã quan sát thấy sự phân chia hiệu quả của vi khuẩn ưa nhiệt kỵ khí (Thermosipho globiformans, thời gian nhân đôi 24 phút) ở 65°C. Vào năm 2020, Pulshen và cộng sự. Việc làm nóng hiệu quả các đĩa kim loại thương mại (AttofluorTM, Thermofisher) đã được chứng minh bằng cách sử dụng hai bộ phận làm nóng tự chế: nắp và bệ (cấu hình lấy cảm hứng từ máy PCR). Sự liên kết này dẫn đến nhiệt độ chất lỏng đồng đều và ngăn chặn sự bay hơi và ngưng tụ ở đáy nắp. Việc sử dụng vòng chữ O tránh trao đổi khí với môi trường. HTM này, được gọi là Máy soi huỳnh quang, được sử dụng để chụp ảnh Sulfolobus acidocaldarius ở 75°C27.
Một hạn chế được công nhận của tất cả các hệ thống này là hạn chế sử dụng vật kính không khí, bất kỳ việc ngâm trong dầu nào đều không phù hợp với nhiệt độ cao như vậy và để tạo ảnh qua các mẫu trong suốt dày >1 mm. Một hạn chế được công nhận của tất cả các hệ thống này là hạn chế sử dụng vật kính không khí, bất kỳ việc ngâm trong dầu nào đều không phù hợp với nhiệt độ cao như vậy và để tạo ảnh qua các mẫu trong suốt dày >1 mm. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, ольку любое имерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и дляеизации рез прозрачные образцы толщиной > 1 mm. Một thiếu sót được thừa nhận của tất cả các hệ thống này là hạn chế trong việc sử dụng vật kính không khí, vì bất kỳ sự ngâm trong dầu nào đều không phù hợp với nhiệt độ cao như vậy và để quan sát qua các mẫu trong suốt dày > 1 mm.1 毫米厚的透明样品成像。 Một hạn chế được công nhận của tất cả các hệ thống này là hạn chế của việc sử dụng gương có không khí, vì bất kỳ phương pháp ngâm dầu nào đều không phù hợp để chụp ảnh các mẫu trong suốt dày >1 mm ở nhiệt độ cao như vậy. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, любое иммерсионное погружение в масло непригодно для таких высоких температур và визуализации через nó có giá trị >1 mm. Một nhược điểm được thừa nhận của tất cả các hệ thống này là việc sử dụng hạn chế các thấu kính không khí, bất kỳ việc ngâm dầu nào đều không phù hợp với nhiệt độ cao như vậy và hiển thị qua các mẫu trong suốt dày >1 mm.Gần đây hơn, hạn chế này đã được Charles-Orzag et al. 28, người đã phát triển một thiết bị không còn cung cấp nhiệt xung quanh hệ thống quan tâm mà thay vào đó là bên trong tấm kính che, được phủ một lớp mỏng trong suốt của điện trở làm từ ITO (indium-tin oxit). Nắp có thể được làm nóng lên tới 75°C bằng cách cho dòng điện chạy qua lớp trong suốt. Tuy nhiên, tác giả cũng phải làm nóng thấu kính đến vật kính nhưng không quá 65 ° C để không làm hỏng thấu kính.
Những công trình này cho thấy sự phát triển của kính hiển vi quang học nhiệt độ cao hiệu quả chưa được áp dụng rộng rãi, thường cần có thiết bị tự chế và thường phải trả giá bằng độ phân giải không gian, đây là một bất lợi nghiêm trọng vì các vi sinh vật ưa nhiệt không lớn hơn một số ít. micromet. Giảm thể tích gia nhiệt là chìa khóa để giải quyết ba vấn đề cố hữu của HTM: độ phân giải không gian kém, quán tính nhiệt cao khi hệ thống nóng lên và sự nóng lên có hại của các bộ phận xung quanh (dầu ngâm, thấu kính vật kính… hoặc tay người dùng) ở nhiệt độ khắc nghiệt. ).
Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu một HTM để quan sát chất ưa nhiệt không dựa trên hệ thống sưởi điện trở. Thay vào đó, chúng tôi đạt được sự gia nhiệt cục bộ trong một vùng giới hạn trong tầm nhìn của kính hiển vi bằng cách chiếu tia laser lên chất nền hấp thụ ánh sáng. Sự phân bố nhiệt độ được hiển thị bằng kính hiển vi pha định lượng (QPM). Hiệu quả của phương pháp này được chứng minh bởi Geobacillus stearothermophilus, một loại vi khuẩn ưa nhiệt di động, sinh sản ở nhiệt độ khoảng 65°C và có thời gian nhân đôi ngắn (khoảng 20 phút) và Sulfolobus shibatae, một loại vi khuẩn ưa nhiệt phát triển tối ưu ở 80°C (vi khuẩn cổ) để minh họa. Tốc độ sao chép bình thường và hoạt động bơi lội được quan sát như một hàm số của nhiệt độ. Tia laser HTM (LA-HTM) này không bị giới hạn bởi độ dày của lớp phủ hoặc bởi tính chất của vật kính (ngâm trong không khí hoặc dầu). Điều này cho phép sử dụng bất kỳ ống kính có độ phân giải cao nào trên thị trường. Nó cũng không bị nóng lên chậm do quán tính nhiệt (đạt được nhiệt độ tức thời ở thang đo mili giây) và chỉ sử dụng các thành phần có sẵn trên thị trường. Mối lo ngại mới duy nhất về an toàn liên quan đến sự hiện diện của chùm tia laser mạnh (thường lên tới 100 mW) bên trong thiết bị và có thể xuyên qua mắt, vốn cần có kính bảo hộ.
Nguyên lý của LA-HTM là sử dụng tia laser để làm nóng mẫu cục bộ trong trường nhìn của kính hiển vi (Hình 1a). Để làm được điều này, mẫu phải hấp thụ ánh sáng. Để sử dụng công suất laser hợp lý (dưới 100 mW), chúng tôi không dựa vào sự hấp thụ ánh sáng của môi trường lỏng mà tăng khả năng hấp thụ của mẫu một cách giả tạo bằng cách phủ lên chất nền các hạt nano vàng (Hình 1c). Làm nóng các hạt nano vàng bằng ánh sáng có tầm quan trọng cơ bản đối với lĩnh vực plasmonics nhiệt, với các ứng dụng được mong đợi trong y sinh, hóa học nano hoặc thu hoạch ánh sáng mặt trời29,30,31. Trong vài năm qua, chúng tôi đã sử dụng LA-HTM này trong một số nghiên cứu liên quan đến ứng dụng plasma nhiệt trong vật lý, hóa học và sinh học. Khó khăn chính của phương pháp này là hiển thị thông số nhiệt độ cuối cùng, vì nhiệt độ tăng cao bị giới hạn ở một vùng vi mô trong mẫu. Chúng tôi đã chỉ ra rằng có thể đạt được ánh xạ nhiệt độ bằng giao thoa kế cắt ngang bốn bước sóng, một phương pháp đơn giản, độ phân giải cao và rất nhạy của kính hiển vi pha định lượng dựa trên việc sử dụng cách tử nhiễu xạ hai chiều (còn được gọi là cách tử chéo) 33,34,35,36. Độ tin cậy của kỹ thuật kính hiển vi nhiệt này, dựa trên kính hiển vi mặt sóng cách tử chéo (CGM), đã được chứng minh trong hàng chục bài báo được xuất bản trong thập kỷ qua37,38,39,40,41,42,43.
Sơ đồ lắp đặt song song kính hiển vi gia nhiệt, tạo hình và đo nhiệt độ bằng laser. b Hình dạng mẫu bao gồm buồng AttofluorTM chứa lớp phủ được phủ các hạt nano vàng. c Nhìn kỹ vào mẫu (không theo tỷ lệ). d biểu thị cấu hình chùm tia laser đồng nhất và (e) sự phân bố nhiệt độ tiếp theo được mô phỏng trên mặt phẳng mẫu của các hạt nano vàng. f là cấu hình chùm tia laze hình khuyên thích hợp để tạo ra nhiệt độ đồng đều như thể hiện trong mô phỏng phân bố nhiệt độ thu được được thể hiện trong (g). Thanh tỷ lệ: 30 µm.
Đặc biệt, gần đây chúng tôi đã làm nóng được tế bào động vật có vú bằng LA-HTM và CGM, đồng thời theo dõi phản ứng sốc nhiệt của tế bào trong khoảng 37-42°C, chứng minh khả năng ứng dụng của kỹ thuật này vào chụp ảnh tế bào sống đơn lẻ. Tuy nhiên, việc ứng dụng LA-HTM vào nghiên cứu vi sinh vật ở nhiệt độ cao không phải là rõ ràng, vì nó đòi hỏi sự thận trọng hơn so với tế bào động vật có vú: trước hết, làm nóng đáy môi trường lên hàng chục độ (chứ không phải vài độ) dẫn đến đến một gradient nhiệt độ thẳng đứng mạnh mẽ. có thể tạo ra sự đối lưu chất lỏng 44, nếu không được gắn chặt vào bề mặt, có thể gây ra sự di chuyển và trộn lẫn vi khuẩn không mong muốn. Sự đối lưu này có thể được loại bỏ bằng cách giảm độ dày của lớp chất lỏng. Với mục đích này, trong tất cả các thí nghiệm được trình bày dưới đây, huyền phù vi khuẩn được đặt giữa hai lớp phủ dày khoảng 15 µm đặt bên trong cốc kim loại (AttofluorTM, Thermofisher, Hình 1b, c). Về nguyên tắc, có thể tránh được sự đối lưu nếu độ dày của chất lỏng nhỏ hơn kích thước chùm tia của tia laser đốt nóng. Thứ hai, làm việc trong một hình học hạn chế như vậy có thể làm chết ngạt các sinh vật hiếu khí (xem Hình S2). Vấn đề này có thể tránh được bằng cách sử dụng chất nền có khả năng thấm oxy (hoặc bất kỳ khí quan trọng nào khác), bằng cách để lại các bọt khí bị mắc kẹt bên trong lớp phủ, hoặc bằng cách khoan các lỗ trên lớp phủ trên cùng (xem Hình S1) 45 . Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn giải pháp sau (Hình 1b và S1). Cuối cùng, sưởi ấm bằng laser không mang lại sự phân bố nhiệt độ đồng đều. Ngay cả ở cùng cường độ của chùm tia laser (Hình 1d), sự phân bố nhiệt độ không đồng đều mà giống với phân bố Gaussian do khuếch tán nhiệt (Hình 1e). Khi mục tiêu là thiết lập nhiệt độ chính xác trong lĩnh vực nghiên cứu hệ thống sinh học, các mặt cắt không đồng đều không lý tưởng và cũng có thể dẫn đến sự di chuyển nhiệt của vi khuẩn nếu chúng không bám vào chất nền (xem Hình S3, S4)39. Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã sử dụng bộ điều biến ánh sáng không gian (SLM) để định hình chùm tia laser hồng ngoại theo hình dạng của vòng (Hình 1f) trong mặt phẳng của mẫu để đạt được sự phân bố nhiệt độ đồng đều hoàn hảo trong một khu vực hình học nhất định, bất chấp sự khuếch tán nhiệt (Hình 1d) 39 , 42, 46. Đặt một lớp phủ trên cùng lên đĩa kim loại (Hình 1b) để tránh sự bay hơi của môi trường và quan sát trong ít nhất vài ngày. Bởi vì lớp phủ trên cùng này không được bịt kín nên có thể dễ dàng thêm môi trường bổ sung vào bất kỳ lúc nào nếu cần thiết.
Để minh họa cách LA-HTM hoạt động và chứng minh khả năng ứng dụng của nó trong nghiên cứu ưa nhiệt, chúng tôi đã nghiên cứu vi khuẩn hiếu khí Geobacillus stearothermophilus, có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng 60-65°C. Vi khuẩn này cũng có tiên mao và khả năng bơi lội, cung cấp một dấu hiệu khác về hoạt động bình thường của tế bào.
Các mẫu (Hình 1b) được ủ trước ở 60°C trong một giờ và sau đó được đặt vào giá đỡ mẫu LA-HTM. Quá trình ủ trước này là tùy chọn nhưng vẫn hữu ích vì hai lý do: Thứ nhất, khi bật tia laser, nó sẽ khiến các tế bào phát triển và phân chia ngay lập tức (xem phim M1 trong Tài liệu bổ sung). Nếu không ủ trước, sự phát triển của vi khuẩn thường bị trì hoãn khoảng 40 phút mỗi lần làm nóng khu vực quan sát mới trên mẫu. Thứ hai, quá trình ủ trước 1 giờ đã thúc đẩy sự bám dính của vi khuẩn với lớp phủ, ngăn không cho các tế bào trôi ra khỏi tầm nhìn do hiện tượng nhiệt di khi bật tia laser (xem phim M2 trong Tài liệu bổ sung). Nhiệt di là sự chuyển động của các hạt hoặc phân tử dọc theo một gradient nhiệt độ, thường là từ nóng đến lạnh và vi khuẩn cũng không ngoại lệ43,47. Hiệu ứng không mong muốn này được loại bỏ trên một khu vực nhất định bằng cách sử dụng SLM để định hình chùm tia laser và đạt được sự phân bố nhiệt độ phẳng.
Trên hình. Hình 2 cho thấy sự phân bố nhiệt độ được đo bằng CGM thu được bằng cách chiếu xạ chất nền thủy tinh được phủ các hạt nano vàng bằng chùm tia laser hình khuyên (Hình 1f). Sự phân bố nhiệt độ phẳng được quan sát thấy trên toàn bộ khu vực được bao phủ bởi chùm tia laze. Vùng này được đặt ở nhiệt độ 65°C, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu. Bên ngoài vùng này, đường cong nhiệt độ tự nhiên rơi xuống \(1/r\) (trong đó \(r\) là tọa độ hướng tâm).
bản đồ nhiệt độ của các phép đo CGM thu được bằng cách sử dụng chùm tia laser hình khuyên để chiếu xạ một lớp hạt nano vàng để thu được cấu hình nhiệt độ phẳng trên một khu vực hình tròn. b Đường đẳng nhiệt của bản đồ nhiệt độ (a). Đường viền của chùm tia laser được thể hiện bằng một vòng tròn chấm màu xám. Thí nghiệm được lặp lại hai lần (xem Tài liệu bổ sung, Hình S4).
Khả năng tồn tại của tế bào vi khuẩn được theo dõi trong vài giờ bằng LA-HTM. Trên hình. Hình 3 hiển thị khoảng thời gian cho bốn hình ảnh được chụp từ một bộ phim dài 3 giờ 20 phút (Phim M3, Thông tin bổ sung). Quan sát thấy vi khuẩn sinh sôi nảy nở tích cực trong khu vực hình tròn được xác định bởi tia laser, nơi nhiệt độ tối ưu, đạt tới 65°C. Ngược lại, sự phát triển của tế bào giảm đáng kể khi nhiệt độ giảm xuống dưới 50°C trong 10 giây.
Hình ảnh độ sâu quang học của vi khuẩn G. stearothermophilus phát triển sau khi đốt nóng bằng laser ở các thời điểm khác nhau, (a) t = 0 phút, (b) 1 giờ 10 phút, (c) 2 giờ 20 phút, (d) 3 giờ 20 phút, trong số 200 Trích từ phim dài một phút (phim M3 được cung cấp trong Thông tin bổ sung) được xếp chồng lên bản đồ nhiệt độ tương ứng. Tia laser bật vào thời điểm \(t=0\). Đường đẳng nhiệt đã được thêm vào hình ảnh cường độ.
Để định lượng thêm sự phát triển của tế bào và sự phụ thuộc của nó vào nhiệt độ, chúng tôi đã đo mức tăng sinh khối của các khuẩn lạc khác nhau của vi khuẩn được phân lập ban đầu trong trường quan sát của Phim M3 (Hình 4). Vi khuẩn bố mẹ được chọn khi bắt đầu hình thành đơn vị hình thành khuẩn lạc nhỏ (mCFU) được thể hiện trong Hình S6. Các phép đo khối lượng khô được thực hiện bằng camera CGM 48 được sử dụng để lập bản đồ phân bổ nhiệt độ. Khả năng CGM đo trọng lượng khô và nhiệt độ là thế mạnh của LA-HTM. Đúng như dự đoán, nhiệt độ cao khiến vi khuẩn phát triển nhanh hơn (Hình 4a). Như được hiển thị trong biểu đồ bán log ở Hình 4b, sự tăng trưởng ở mọi nhiệt độ tuân theo sự tăng trưởng theo cấp số nhân, trong đó dữ liệu sử dụng hàm số mũ \(m={m__{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), trong đó \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – thời gian tạo (hoặc thời gian nhân đôi), \( g =1/ \tau\) – tốc độ tăng trưởng (số lần chia trên một đơn vị thời gian ). Trên hình. Hình 4c cho thấy tốc độ tăng trưởng và thời gian thế hệ tương ứng là hàm số của nhiệt độ. Các mCFU phát triển nhanh được đặc trưng bởi sự tăng trưởng bão hòa sau hai giờ, một hành vi được mong đợi do mật độ vi khuẩn cao (tương tự như pha tĩnh trong môi trường nuôi cấy lỏng cổ điển). Hình dạng chung \(g\left(T\right)\) (Hình 4c) tương ứng với đường cong hai pha dự kiến của G. stearothermophilus với tốc độ tăng trưởng tối ưu khoảng 60-65°C. So khớp dữ liệu bằng mô hình số liệu (Hình S5)49 trong đó \(\left({{G} _{0}{;\;T}__{{\min }};{T} _{{opt} } ;{T__{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, rất phù hợp với các giá trị khác được trích dẫn trong tài liệu49. Mặc dù các tham số phụ thuộc vào nhiệt độ có thể tái tạo được nhưng tốc độ tăng trưởng tối đa của \({G} _{0}\) có thể thay đổi tùy theo thử nghiệm này sang thử nghiệm khác (xem hình S7-S9 và phim M4). Ngược lại với các thông số điều chỉnh nhiệt độ cần phải phổ biến, tốc độ tăng trưởng tối đa phụ thuộc vào đặc tính của môi trường (sự sẵn có của chất dinh dưỡng, nồng độ oxy) trong phạm vi hình học vi mô quan sát được.
a Sự phát triển của vi sinh vật ở các nhiệt độ khác nhau. mCFU: Đơn vị hình thành thuộc địa thu nhỏ. Dữ liệu thu được từ video về một loại vi khuẩn phát triển theo gradient nhiệt độ (phim M3). b Tương tự như (a), thang đo bán logarit. c Tốc độ tăng trưởng\(\tau\) và thời gian thế hệ\(g\) được tính từ hồi quy tuyến tính (b). Thanh lỗi ngang: phạm vi nhiệt độ mà mCFU mở rộng sang trường quan sát trong quá trình tăng trưởng. Thanh lỗi dọc: lỗi chuẩn hồi quy tuyến tính.
Ngoài sự phát triển bình thường, một số vi khuẩn đôi khi xuất hiện trong tầm nhìn trong quá trình đốt nóng bằng laser, đây là hành vi được mong đợi đối với vi khuẩn có roi. Bộ phim M5 cung cấp thông tin bổ sung cho thấy các hoạt động bơi lội như vậy. Trong thí nghiệm này, bức xạ laser đồng đều được sử dụng để tạo ra gradient nhiệt độ, như trong Hình 1d, e và S3. Hình 5 cho thấy hai chuỗi hình ảnh được chọn từ phim M5 cho thấy một vi khuẩn thể hiện chuyển động có hướng trong khi tất cả các vi khuẩn khác vẫn bất động.
Hai khung thời gian (a) và (b) hiển thị hoạt động bơi lội của hai loại vi khuẩn khác nhau được đánh dấu bằng các vòng tròn chấm. Các hình ảnh được trích từ phim M5 (được cung cấp dưới dạng tài liệu bổ sung).
Trong trường hợp của G. stearothermophilus, sự chuyển động tích cực của vi khuẩn (Hình 5) bắt đầu vài giây sau khi bật chùm tia laze. Quan sát này nhấn mạnh phản ứng tạm thời của vi sinh vật ưa nhiệt này đối với sự gia tăng nhiệt độ, như Mora et al đã quan sát. 24 . Chủ đề về khả năng di chuyển của vi khuẩn và thậm chí cả khả năng điều nhiệt có thể được khám phá thêm bằng cách sử dụng LA-HTM.
Không nên nhầm lẫn bơi lội của vi sinh vật với các loại chuyển động vật lý khác, cụ thể là (i) Chuyển động Brown, dường như là chuyển động hỗn loạn không có hướng xác định, (ii) đối lưu 50 và nhiệt di 43, bao gồm một chuyển động trôi đều đặn dọc theo nhiệt độ độ dốc.
G. stearothermophilus được biết đến với khả năng tạo ra các bào tử có khả năng kháng cự cao (hình thành bào tử) khi tiếp xúc với các điều kiện môi trường bất lợi như một biện pháp phòng vệ. Khi điều kiện môi trường thuận lợi trở lại, bào tử nảy mầm, hình thành tế bào sống và tiếp tục phát triển. Mặc dù quá trình hình thành bào tử/nảy mầm này đã được nhiều người biết đến nhưng nó chưa bao giờ được quan sát thực tế. Sử dụng LA-HTM, chúng tôi báo cáo ở đây quan sát đầu tiên về các sự kiện nảy mầm ở G. stearothermophilus.
Trên hình. 6a hiển thị hình ảnh tua nhanh thời gian về độ sâu quang học (OT) thu được bằng cách sử dụng bộ CGM gồm 13 bào tử. Trong toàn bộ thời gian thu thập (15 giờ 6 phút, \(t=0\) – thời điểm bắt đầu gia nhiệt bằng laser), 4 trong số 13 bào tử đã nảy mầm, tại các thời điểm liên tiếp \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' và \(11\) h \(30\)'. Mặc dù chỉ một trong những sự kiện này được hiển thị trong Hình 6, nhưng có thể quan sát thấy 4 sự kiện nảy mầm trong phim M6 trong tài liệu bổ sung. Điều thú vị là sự nảy mầm dường như là ngẫu nhiên: không phải tất cả các bào tử đều nảy mầm và không nảy mầm cùng một lúc, mặc dù có những thay đổi giống nhau về điều kiện môi trường.
một khoảng thời gian trôi đi bao gồm 8 hình ảnh OT (ngâm dầu, mục tiêu 60x, 1,25 NA) và (b) tiến hóa sinh khối của tập hợp G. stearothermophilus. c (b) Vẽ trên thang bán log để làm nổi bật tính tuyến tính của tốc độ tăng trưởng (đường đứt nét).
Trên hình. Hình 6b,c hiển thị sinh khối của quần thể tế bào trong trường quan sát dưới dạng hàm theo thời gian trong toàn bộ thời gian thu thập dữ liệu. Sự phân rã nhanh của khối lượng khô được quan sát thấy ở \(t=5\)h trong hình. 6b, c, do một số ô thoát ra khỏi trường nhìn. Tốc độ tăng trưởng của bốn sự kiện này là \(0,77\pm 0,1\) h-1. Giá trị này cao hơn tốc độ tăng trưởng liên quan đến Hình 3. 3 và 4, trong đó các tế bào phát triển bình thường. Lý do khiến tốc độ tăng trưởng của G. stearothermophilus từ bào tử tăng lên vẫn chưa rõ ràng, nhưng những phép đo này nêu bật sự quan tâm của LA-HTM và hoạt động ở cấp độ tế bào đơn lẻ (hoặc ở cấp độ mCFU đơn lẻ) để tìm hiểu thêm về động lực học của đời sống tế bào .
Để chứng minh thêm tính linh hoạt của LA-HTM và hiệu quả của nó ở nhiệt độ cao, chúng tôi đã kiểm tra sự phát triển của Sulfolobus shibatae, một vi khuẩn cổ ưa axit ưa nhiệt với nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 80°C51. So với G. stearothermophilus, những vi khuẩn cổ này cũng có hình thái rất khác, giống hình cầu 1 micron (cocci) chứ không phải hình que dài (trực khuẩn).
Hình 7a bao gồm các hình ảnh độ sâu quang học tuần tự của S. shibatae mCFU thu được bằng CGM (xem phim truyện M7 trong Tài liệu bổ sung). mCFU này phát triển ở khoảng 73°C, dưới nhiệt độ tối ưu là 80°C, nhưng nằm trong phạm vi nhiệt độ để tăng trưởng tích cực. Chúng tôi đã quan sát thấy nhiều sự kiện phân hạch khiến mCFU trông giống như những vi khuẩn cổ sau vài giờ. Từ những hình ảnh OT này, sinh khối mCFU được đo theo thời gian và được trình bày trong Hình 7b. Điều thú vị là, các mCFU của S. shibatae cho thấy sự tăng trưởng tuyến tính thay vì tăng trưởng theo cấp số nhân như ở các mCFU của G. stearothermophilus. Đã có một cuộc thảo luận lâu dài về bản chất của tốc độ tăng trưởng tế bào: trong khi một số nghiên cứu báo cáo tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn tỷ lệ thuận với kích thước của chúng (tăng trưởng theo cấp số nhân), các nghiên cứu khác cho thấy tốc độ không đổi (tăng trưởng tuyến tính hoặc song tuyến). Như Tzur và cộng sự53 đã giải thích, việc phân biệt giữa tăng trưởng tuyến tính theo hàm mũ và (bi) tuyến tính đòi hỏi độ chính xác <6% trong các phép đo sinh khối, điều này nằm ngoài tầm với của hầu hết các kỹ thuật QPM, thậm chí liên quan đến phép đo giao thoa. Như Tzur và cộng sự53 đã giải thích, việc phân biệt giữa tăng trưởng tuyến tính theo hàm mũ và (bi) tuyến tính đòi hỏi độ chính xác <6% trong các phép đo sinh khối, điều này nằm ngoài tầm với của hầu hết các kỹ thuật QPM, thậm chí liên quan đến phép đo giao thoa. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в không có vấn đề gì, bạn không cần phải làm gì với QPM, bạn có thể sử dụng công cụ này. Như Zur và cộng sự53 đã giải thích, việc phân biệt giữa tăng trưởng tuyến tính theo hàm mũ và (hai) tuyến tính đòi hỏi độ chính xác <6% trong các phép đo sinh khối, điều này không thể đạt được đối với hầu hết các phương pháp QPM, ngay cả khi sử dụng giao thoa kế.Theo giải thích của Zur et al. 53, việc phân biệt giữa tăng trưởng tuyến tính theo hàm mũ và (bi) tuyến tính đòi hỏi độ chính xác dưới 6% trong các phép đo sinh khối, điều này không thể đạt được đối với hầu hết các phương pháp QPM, ngay cả khi sử dụng phép đo giao thoa. CGM đạt được độ chính xác này với độ chính xác dưới pg trong các phép đo sinh khối36,48.
một khoảng thời gian trôi đi bao gồm 6 hình ảnh OT (ngâm dầu, 60x, mục tiêu NA 1.25) và (b) tiến hóa sinh khối micro-CFU được đo bằng CGM. Xem phim M7 để biết thêm thông tin.
Sự tăng trưởng tuyến tính hoàn hảo của S. shibatae là bất ngờ và chưa được báo cáo. Tuy nhiên, sự tăng trưởng theo cấp số nhân được mong đợi, ít nhất là vì theo thời gian, phải xảy ra nhiều quá trình phân chia gồm 2, 4, 8, 16 …. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng sự tăng trưởng tuyến tính có thể là do sự ức chế tế bào do sự đóng gói tế bào dày đặc, giống như sự phát triển của tế bào chậm lại và cuối cùng đạt đến trạng thái không hoạt động khi mật độ tế bào quá cao.
Chúng tôi kết luận bằng cách thảo luận lần lượt năm điểm quan tâm sau: giảm thể tích gia nhiệt, giảm quán tính nhiệt, quan tâm đến hạt nano vàng, quan tâm đến kính hiển vi pha định lượng và phạm vi nhiệt độ có thể sử dụng LA-HTM.
So với gia nhiệt bằng điện trở, gia nhiệt bằng laser được sử dụng để phát triển HTM mang lại một số lợi thế mà chúng tôi minh họa trong nghiên cứu này. Đặc biệt, trong môi trường lỏng trong trường quan sát của kính hiển vi, thể tích gia nhiệt được giữ trong khoảng vài (10 μm) 3 thể tích. Bằng cách này, chỉ các vi khuẩn được quan sát là hoạt động, trong khi các vi khuẩn khác không hoạt động và có thể được sử dụng để nghiên cứu thêm về mẫu – không cần phải thay đổi mẫu mỗi khi cần kiểm tra nhiệt độ mới. Ngoài ra, gia nhiệt ở quy mô vi mô cho phép kiểm tra trực tiếp một phạm vi nhiệt độ lớn: Hình 4c thu được từ một bộ phim dài 3 giờ (Phim M3), thường yêu cầu chuẩn bị và kiểm tra một số mẫu - một mẫu cho mỗi mẫu được nghiên cứu. y là nhiệt độ biểu thị số ngày thí nghiệm. Việc giảm thể tích được làm nóng cũng giữ cho tất cả các thành phần quang học xung quanh của kính hiển vi, đặc biệt là vật kính, ở nhiệt độ phòng, đây là một vấn đề lớn mà cộng đồng phải đối mặt cho đến nay. LA-HTM có thể được sử dụng với bất kỳ thấu kính nào, kể cả thấu kính ngâm trong dầu và sẽ duy trì ở nhiệt độ phòng ngay cả với nhiệt độ khắc nghiệt trong trường nhìn. Hạn chế chính của phương pháp đốt nóng bằng laser mà chúng tôi báo cáo trong nghiên cứu này là các tế bào không bám dính hoặc nổi có thể ở xa tầm nhìn và khó nghiên cứu. Một giải pháp thay thế có thể là sử dụng thấu kính có độ phóng đại thấp để đạt được mức tăng nhiệt độ lớn hơn vài trăm micron. Sự thận trọng này đi kèm với việc giảm độ phân giải không gian, nhưng nếu mục tiêu là nghiên cứu sự chuyển động của vi sinh vật thì không cần độ phân giải không gian cao.
Thang thời gian để sưởi ấm (và làm mát) hệ thống \({{{{\rm{\tau }}}}}}}__{{\mbox{D}}}}\) phụ thuộc vào kích thước của nó , theo định luật \({{{({\rm{\tau }}}}}}__{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), trong đó \ (L\ ) là kích thước đặc trưng của nguồn nhiệt (đường kính của chùm tia laser trong nghiên cứu của chúng tôi là \(L\ khoảng 100\) μm), \(D\) là độ khuếch tán nhiệt của môi trường (trung bình ở chúng tôi trường hợp, thủy tinh và nước Tốc độ khuếch tán\(D\ khoảng 2\gấp {10}^{-7}\) m2/s). Do đó, trong nghiên cứu này, phản hồi thời gian ở mức 50 ms, tức là gần như tức thời. có thể dự đoán được sự thay đổi nhiệt độ. Việc thiết lập mức tăng nhiệt độ tức thời này không chỉ rút ngắn thời gian của thí nghiệm mà còn cho phép tính thời gian chính xác \(t=0\) cho bất kỳ nghiên cứu động nào về hiệu ứng nhiệt độ.
Phương pháp đề xuất của chúng tôi có thể áp dụng cho bất kỳ chất nền hấp thụ ánh sáng nào (ví dụ: các mẫu thương mại có lớp phủ ITO). Tuy nhiên, các hạt nano vàng có thể cung cấp độ hấp thụ cao ở vùng hồng ngoại và độ hấp thụ thấp ở vùng khả kiến, những đặc điểm sau được quan tâm để quan sát quang học hiệu quả trong vùng khả kiến, đặc biệt là khi sử dụng huỳnh quang. Ngoài ra, vàng có tính tương thích sinh học, trơ về mặt hóa học, mật độ quang học có thể điều chỉnh từ 530 nm đến gần hồng ngoại, việc chuẩn bị mẫu rất đơn giản và tiết kiệm29.
Kính hiển vi mặt sóng cách tử ngang (CGM) không chỉ cho phép lập bản đồ nhiệt độ ở cấp độ vi mô mà còn theo dõi sinh khối, khiến nó đặc biệt hữu ích (nếu không cần thiết) khi kết hợp với LA-HTM. Trong thập kỷ qua, các kỹ thuật kính hiển vi nhiệt độ khác đã được phát triển, đặc biệt là trong lĩnh vực hình ảnh sinh học và hầu hết chúng đều yêu cầu sử dụng đầu dò huỳnh quang nhạy cảm với nhiệt độ54,55. Tuy nhiên, những phương pháp này đã bị chỉ trích và một số báo cáo đã đo lường sự thay đổi nhiệt độ không thực tế trong tế bào, có thể là do huỳnh quang phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác ngoài nhiệt độ. Ngoài ra, hầu hết các đầu dò huỳnh quang đều không ổn định ở nhiệt độ cao. Do đó, QPM và đặc biệt là CGM đại diện cho kỹ thuật kính hiển vi nhiệt độ lý tưởng để nghiên cứu sự sống ở nhiệt độ cao bằng kính hiển vi quang học.
Các nghiên cứu về S. shibatae, sống tối ưu ở 80°C, cho thấy LA-HTM có thể được áp dụng để nghiên cứu các loài ưa nhiệt chứ không chỉ các loài ưa nhiệt đơn giản. Về nguyên tắc, không có giới hạn về phạm vi nhiệt độ có thể đạt được khi sử dụng LA-HTM và thậm chí có thể đạt được nhiệt độ trên 100°C ở áp suất khí quyển mà không cần đun sôi, như đã được chứng minh bởi nhóm 38 người của chúng tôi trong các ứng dụng hóa học thủy nhiệt ở áp suất khí quyển. áp suất A. Một tia laser được sử dụng để nung nóng các hạt nano vàng 40 theo cách tương tự. Do đó, LA-HTM có tiềm năng được sử dụng để quan sát các vi khuẩn siêu nhiệt chưa từng có bằng kính hiển vi quang học có độ phân giải cao tiêu chuẩn trong điều kiện tiêu chuẩn (tức là dưới áp lực môi trường).
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện bằng kính hiển vi tự chế, bao gồm chiếu sáng Köhler (có đèn LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), giá đỡ mẫu với chuyển động xy thủ công, vật kính (Olympus, 60x, 0,7 NA, không khí, LUCPlanFLN60X hoặc 60x, 1,25 NA, Dầu , UPLFLN60XOI), camera CGM (cách tử chéo QLSI, khoảng cách 39 µm, cách cảm biến camera Andor Zyla 0,87 mm) để cung cấp hình ảnh cường độ và mặt sóng và camera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, chế độ 16-bit, từ Hamamatsu) để ghi lại dữ liệu được hiển thị trong Hình 5 (vi khuẩn bơi). Bộ tách chùm tia lưỡng sắc có cạnh BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Bộ lọc ở mặt trước của máy ảnh là bộ lọc thông ngắn 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Laser sapphire titan (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, khoang laser sóng thần được bơm, Vật lý quang phổ trong Hình 2-5, được thay thế thêm bằng laser Millenia, Vật lý quang phổ 10 W, khoang laser Mira được bơm, Coherent, cho Hình 2 -5). 6 và 7) được đặt ở bước sóng \({{{({\rm{\lambda }}}}}=800\) nm, tương ứng với phổ cộng hưởng plasmon của hạt nano vàng. 1152 pixel) được mua từ Meadowlark Optics. Các ảnh ba chiều được tính toán bằng thuật toán Gerchberg-Saxton như được mô tả trong liên kết 39.
Kính hiển vi mặt sóng cách tử chéo (CGM) là một kỹ thuật kính hiển vi quang học dựa trên việc kết hợp cách tử nhiễu xạ hai chiều (còn được gọi là cách tử chéo) ở khoảng cách một milimet từ cảm biến của máy ảnh thông thường. Ví dụ phổ biến nhất về CGM mà chúng tôi đã sử dụng trong nghiên cứu này được gọi là giao thoa kế dịch chuyển ngang bốn bước sóng (QLSI), trong đó cách tử chéo bao gồm mẫu bàn cờ cường độ/pha được giới thiệu và cấp bằng sáng chế bởi Primot et al. vào năm 200034. Các đường cách tử dọc và ngang tạo ra các bóng dạng lưới trên cảm biến, độ biến dạng của chúng có thể được xử lý số trong thời gian thực để thu được độ méo mặt sóng quang học (hoặc cấu hình pha tương đương) của ánh sáng tới. Khi được sử dụng trên kính hiển vi, máy ảnh CGM có thể hiển thị độ lệch đường quang của vật thể được chụp ảnh, còn được gọi là độ sâu quang học (OT), với độ nhạy ở mức nanomet36. Trong bất kỳ phép đo CGM nào, để loại bỏ bất kỳ khiếm khuyết nào trong các thành phần quang học hoặc chùm tia, hình ảnh OT tham chiếu chính phải được chụp và loại bỏ khỏi mọi hình ảnh tiếp theo.
Kính hiển vi nhiệt độ được thực hiện bằng camera CGM như được mô tả trong tài liệu tham khảo. 32. Nói tóm lại, việc đun nóng một chất lỏng sẽ làm thay đổi chiết suất của nó, tạo ra hiệu ứng thấu kính nhiệt làm biến dạng chùm tia tới. Độ méo mặt sóng này được đo bằng CGM và được xử lý bằng thuật toán giải mã để thu được sự phân bố nhiệt độ ba chiều trong môi trường lỏng. Nếu các hạt nano vàng được phân bổ đều khắp mẫu, việc lập bản đồ nhiệt độ có thể được thực hiện ở những khu vực không có vi khuẩn để tạo ra hình ảnh tốt hơn, đó là điều chúng ta đôi khi làm. Hình ảnh CGM tham chiếu được thu được mà không làm nóng (tắt tia laser) và sau đó được chụp tại cùng một vị trí trong ảnh khi bật tia laser.
Việc đo khối lượng khô được thực hiện bằng cách sử dụng cùng một camera CGM được sử dụng để chụp ảnh nhiệt độ. Hình ảnh tham chiếu CGM thu được bằng cách di chuyển nhanh mẫu theo x và y trong quá trình phơi nhiễm như một phương tiện để lấy trung bình bất kỳ sự không đồng nhất nào trong OT do sự hiện diện của vi khuẩn. Từ hình ảnh OT của vi khuẩn, sinh khối của chúng thu được bằng cách sử dụng tập hợp các hình ảnh trên các khu vực được chọn bằng thuật toán phân đoạn tự chế của Matlab (xem tiểu mục “Mã số”), theo quy trình được mô tả trong tài liệu tham khảo. 48. Tóm lại, chúng ta sử dụng mối quan hệ \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), trong đó \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) là hình ảnh độ sâu quang học, \(m\) là trọng lượng khô và \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) là một hằng số. Chúng tôi đã chọn \({{{\rm{\alpha)))))=0,18\) µm3/pg, đây là hằng số điển hình cho các tế bào sống.
Một tấm phủ có đường kính 25 mm và dày 150 µm được phủ các hạt nano vàng được đặt vào buồng AttofluorTM (Thermofisher) với các hạt nano vàng hướng lên trên. Geobacillus stearothermophilus được nuôi cấy qua đêm trong môi trường LB (200 vòng/phút, 60°C) trước mỗi ngày thí nghiệm. Một giọt 5 µl huyền phù của G. stearothermophilus có mật độ quang học (OD) từ 0,3 đến 0,5 được đặt trên một tấm phủ có chứa các hạt nano vàng. Sau đó, một tấm phủ tròn có đường kính 18 mm có lỗ có đường kính 5 mm ở giữa được thả xuống giọt và 5 μl huyền phù vi khuẩn có cùng mật độ quang học được áp dụng nhiều lần vào tâm lỗ. Các giếng trên nắp đậy được chuẩn bị theo quy trình được mô tả trong tài liệu tham khảo. 45 (xem Thông tin bổ sung để biết thêm thông tin). Sau đó thêm 1 ml môi trường LB vào lá kính phủ để tránh lớp chất lỏng bị khô. Lớp phủ cuối cùng được đặt trên nắp đậy kín của buồng Attofluor™ để tránh sự bay hơi của môi trường trong quá trình ủ. Đối với các thí nghiệm nảy mầm, chúng tôi sử dụng các bào tử, sau các thí nghiệm thông thường, đôi khi chúng che phủ lớp phủ trên cùng. Một phương pháp tương tự đã được sử dụng để thu được Sulfolobus shibatae. Ba ngày (200 vòng/phút, 75°C) nuôi cấy sơ bộ Thiobacillus serrata được thực hiện trên môi trường 182 (DSMZ).
Các mẫu hạt nano vàng được chuẩn bị bằng phương pháp in thạch bản copolyme khối Micellar. Quá trình này được mô tả chi tiết trong Chương. 60. Tóm lại, các mixen bao bọc ion vàng được tổng hợp bằng cách trộn chất đồng trùng hợp với HAuCl4 trong toluene. Sau đó, các lá kính đã được làm sạch được ngâm trong dung dịch và xử lý bằng chiếu tia UV với sự có mặt của chất khử để thu được hạt vàng. Cuối cùng, hạt vàng được phát triển bằng cách cho lá kính tiếp xúc với dung dịch nước KAuCl4 và etanolamine trong 16 phút, dẫn đến sự sắp xếp gần như tuần hoàn và rất đồng đều của các hạt nano vàng không hình cầu trong vùng hồng ngoại gần.
Để chuyển đổi giao thoa kế thành hình ảnh OT, chúng tôi đã sử dụng thuật toán tự chế, như chi tiết trong liên kết. 33 và có sẵn dưới dạng gói Matlab trong kho lưu trữ công cộng sau: https://github.com/baffou/CGMprocess. Gói này có thể tính toán cường độ và hình ảnh OT dựa trên giao thoa kế được ghi lại (bao gồm cả hình ảnh tham chiếu) và khoảng cách dãy camera.
Để tính toán mẫu pha được áp dụng cho SLM nhằm thu được cấu hình nhiệt độ nhất định, chúng tôi đã sử dụng thuật toán tự chế đã phát triển trước đó có sẵn trong kho lưu trữ công cộng sau: https://github.com/baffou/SLM_temper. Đầu vào là trường nhiệt độ mong muốn, có thể được đặt bằng kỹ thuật số hoặc thông qua hình ảnh bmp đơn sắc.
Để phân đoạn các ô và đo trọng lượng khô của chúng, chúng tôi đã sử dụng thuật toán Matlab được xuất bản trong kho lưu trữ công cộng sau: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Trên mỗi hình ảnh, người dùng phải nhấp vào vi khuẩn hoặc mCFU quan tâm, điều chỉnh độ nhạy của cây quét và xác nhận lựa chọn.
Để biết thêm thông tin về thiết kế nghiên cứu, hãy xem bản tóm tắt Báo cáo Nghiên cứu Tự nhiên được liên kết với bài viết này.
Dữ liệu hỗ trợ kết quả của nghiên cứu này được cung cấp từ các tác giả tương ứng theo yêu cầu hợp lý.
Mã nguồn được sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày chi tiết trong phần Phương pháp và có thể tải xuống các phiên bản gỡ lỗi từ https://github.com/baffou/ trong các kho lưu trữ sau: SLM_coffeeShaping, CGMprocess và CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Hiểu biết sâu sắc về chất ưa nhiệt và các ứng dụng phổ rộng của chúng. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Hiểu biết sâu sắc về chất ưa nhiệt và các ứng dụng phổ rộng của chúng.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. và Sharma, AK Tổng quan về chất ưa nhiệt và ứng dụng rộng rãi của chúng. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. và Sharma AK Hiểu biết sâu sắc về sinh vật ưa nhiệt và nhiều ứng dụng.3 Công nghệ sinh học 6, 81 (2016).
Thời gian đăng: 26-09-2022